Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化微波輔助提取酵母胞內(nèi)海藻糖的工藝

宋曉麗，李 歷，李軍慶，張慶文，洪厚勝*

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

海藻糖是一種可溶性的非還原性雙糖，它有3種同分異構(gòu)體：α,α-海藻糖、α,β-海藻糖和β,β-海藻糖，但只有α,α-海藻糖（1-O-（α-D-glucopyranosyl）-α-D-Glucopyranoside，相對分子質(zhì)量Mr=378）在生物體中發(fā)現(xiàn)[1]。它廣泛存在于細(xì)菌[2-3]、真菌[4]、酵母、昆蟲、線蟲、蝦和植物[5-7]中，尤其是在酵母細(xì)胞中含量高達(dá)15%[8]。它是由2個(gè)α-D葡萄糖分子通過α,α-1,1糖苷鍵連接而成的雙糖，它是天然雙糖中最穩(wěn)定的糖，為典型的應(yīng)急代謝物，只被特異性的海藻糖酶降解成葡萄糖，它具有防止生物體脫水[9]、抵抗高溫[10]、氧自由基損傷的保護(hù)[11-12]、抵抗寒冷[13]和作為信號分子或生長調(diào)節(jié)因子[14]等功能，這使其在生物化學(xué)、食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到了非常廣泛的應(yīng)用[15]。為此，近年來世界范圍內(nèi)掀起了研究海藻糖的熱潮。

在工業(yè)生產(chǎn)中，海藻糖主要是從面包酵母中提取的。在Saccharomycescerevisiae中，合成酶和水解酶調(diào)節(jié)胞內(nèi)海藻糖含量。YOSHIKAWA Y等人報(bào)道海藻糖水解酶—海藻糖酶與海藻糖共存于酵母細(xì)胞內(nèi)，它是影響海藻糖提取得率高低的關(guān)鍵因素之一，因此，酵母胞內(nèi)海藻糖的提取必須抑制海藻糖酶活性[16]。另外，從動力學(xué)角度考慮，酵母細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜的通透性是限制海藻糖提取速率的關(guān)鍵因素，故需要破碎酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，這將加速海藻糖的釋放。

本實(shí)驗(yàn)基于微波法的高選擇性、高穿透性、瞬時(shí)性和高效性等特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了微波滅活海藻糖酶和破碎酵母細(xì)胞，輔助三氯乙酸溶液提取海藻糖的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

三氯乙酸（TCA）（AR）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；

海藻糖（BR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

葡萄酒高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；

1200型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；

PJ21C-BF微波爐：美的微波爐制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海藻糖含量測定——HPLC法

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱量海藻糖1g，溶解定容至100mL容量瓶中，然后稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.00g/L、4.00g/L、3.00g/L、2.00g/L和1.00g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

色譜條件：Agilent公司1200型高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)：色譜柱：Bio-rad HPX-87H（300mm×7.8mm）；柱溫：25℃；流動相：5mmol/L硫酸；流速：0.6mL/min；進(jìn)料量：20μL。

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和海藻糖提取液的HPLC分析：

繪制海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別測定5個(gè)不同質(zhì)量濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中海藻糖含量的測定：將海藻糖提取液稀釋100倍后，用0.22μm的針式濾頭過濾后進(jìn)樣。

1.2.2 海藻糖提取工藝

將1.5g酵母置于100mL三角瓶中，均勻鋪成薄層，置于微波爐內(nèi)能量分布均勻位置，在一定微波功率下處理一定時(shí)間，取出后加入三氯乙酸溶液浸提，然后離心分離，上清液即為海藻糖提取液。

1.2.3 微波法滅酶對海藻糖得率的影響

（1）不同微波功率對海藻糖得率的影響

在微波處理時(shí)間60s、三氯乙酸濃度0.5mol/L、三氯乙酸用量50mL、提取時(shí)間100min、提取溫度40℃的條件下，對比分析微波處理功率分別為119W、231W、385W、539W和700W 5種實(shí)驗(yàn)條件下海藻糖的得率。

（2）不同微波作用時(shí)間對海藻糖得率的影響

在微波處理功率539W、三氯乙酸濃度0.5mol/L、三氯乙酸用量50mL、提取時(shí)間100min、提取溫度40℃的條件下，對比分析微波處理時(shí)間分別為15s、30s、45s、60s和75s5種實(shí)驗(yàn)條件下海藻糖的得率。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化海藻糖提取的最佳工藝條件設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上選取三氯乙酸濃度、三氯乙酸用量、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因子為自變量，分別表示為X1、X2、X3、X4，以海藻糖得率Y（mg/g dry cell）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)了4因子3水平共27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素與水平編碼表見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及海藻糖提取液中海藻糖含量的測定

分別測定5個(gè)不同質(zhì)量濃度的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，其回歸方程為：y=2.816×105x+5.411×102，相關(guān)系數(shù)R2=0.99997，線性關(guān)系良好。圖2為3.00g/L海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC圖。

表1 因素與水平編碼表Table 1 Factors and level of coding table

圖1 海藻糖的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 HPLC standard curve of trehalose

圖2 3.00g/L海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品（b）的HPLC圖Fig.2 The HPLC chart of 3.00g/L trehalose standards(a)and the sample(b)

由圖2可知，海藻糖在7.67min左右出峰。

2.2 微波法滅酶對海藻糖得率的影響

2.2.1 不同微波功率對海藻糖得率的影響

微波滅酶功率對葡萄酒高活性干酵中母海藻糖提取得率的影響程度見圖3。

圖3 微波功率對滅酶效果的影響Fig.3 Effect of microwave power on enzyme inactivation

由圖3可知，隨著微波功率的提高，海藻糖含量呈下降的趨勢；功率為119W時(shí)海藻糖得率最高。

2.2.2 不同微波作用時(shí)間對海藻糖得率的影響

微波滅酶時(shí)間對葡萄酒高活性干酵中母海藻糖提取得率的影響程度見圖4。

圖4 微波作用時(shí)間對滅酶效果的影響Fig.4 Effect of microwave time on enzyme inactivation

由圖4可知，用微波滅酶處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，海藻糖得率增加；微波作用時(shí)間為45s時(shí)海藻糖得率最高。表明微波處理45s時(shí)海藻糖酶基本已失活。

由圖3和圖4中結(jié)果可以知道，海藻糖酶適宜滅活方法為微波滅酶119W、45s。

2.3 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.5b設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，以X1、X2、X3、X4為自變量，以海藻糖得率為響應(yīng)值Y，測定結(jié)果見表2。其中實(shí)驗(yàn)序號1、3～13、15～19、20～22、24～25和27～29為析因?qū)嶒?yàn)，2、14、20、23和26為5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面分析法實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.4 回歸模型的建立與方差分析

借助統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert8.0.5b對表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，建立二次多元回歸方程，對該方程的回歸分析與方差分析結(jié)果見表3。得到擬合方程為：

Y=243.72-1.17X1+2.38X2+3.72X3+2.82X4+.43X1X1-1.52X1X3-2.48X1X4-3.99X22-3.50X2X3+2.27X2X4+00.65X3X4-0.97

其中Y為海藻糖含量（mg/gdry cell），X1、X2、X3和X4分別為三氯乙酸濃度（mol/L）、三氯乙酸用量（mL）、提取時(shí)間（min）和提取溫度（℃）。

對此模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3。由表3可知，二次回歸模型的F=21.78>F0.01（14，4）=14.24，p<0.0001，表明該模型回歸非常顯著（p<0.01）；失擬項(xiàng)的F=4.78

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and analysis of variance

回歸方程分析結(jié)果表明：X2、X3、X4、X1X4、X2X3、X2X4和均為回歸模型的極顯著因素（p<0.01）；是顯著因素（p<0.05）。交互項(xiàng)X1X4、X2X3、X2X4極顯著，X1X3顯著，表明三氯乙酸濃度和提取溫度、三氯乙酸用量和提取時(shí)間、三氯乙酸用量和提取溫度之間的交互作用極顯著，X1X3之間的交互作用顯著。借助Design-Expert 8.0.5b對上述回歸方程所作出的響應(yīng)曲面圖見圖5，各因子及其交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過該組圖直觀反映出來。

應(yīng)用響應(yīng)面法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為：三氯乙酸濃度0.43mol/L、三氯乙酸用量41.95mL、提取時(shí)間88.75min、提取溫度34.19℃。在響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到酵母中海藻糖得率為251.86mg/gdry cell，預(yù)測值與實(shí)際測量值非常接近，說明響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。

3 結(jié)論

由微波法滅酶對海藻糖得率的影響的單因素實(shí)驗(yàn)中可以看出，海藻糖酶適宜滅活方法為微波滅酶119W、45s。在此條件下，酵母細(xì)胞中的海藻糖酶活性得到較大抑制，不利于分解海藻糖，從而提高海藻糖的得率。

圖5 各因素交互作用對海藻糖得率的影響規(guī)律Fig.5 Interaction effect of factors on trehalose yield

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert8.0.5b采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對酵母中海藻糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，三氯乙酸用量、提取時(shí)間、提取溫度對海藻糖浸提影響最顯著，并且三氯乙酸濃度和提取溫度、三氯乙酸用量和提取時(shí)間、三氯乙酸用量和提取溫度之間存在交互作用。通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.5b建立了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，并且得到海藻糖提取工藝最優(yōu)條件為：三氯乙酸濃度0.43mol/L、三氯乙酸用量41.95mL、提取時(shí)間88.75min、提取溫度34.19℃。經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知在最優(yōu)提取工藝條件下海藻糖得率可達(dá)到251.86mg/g dry cell，回歸模型的預(yù)測值與實(shí)測值的相對誤差<1%，為以后的中試以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

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