轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 對(duì)種植體表面成骨細(xì)胞I 型膠原蛋白基因表達(dá)研究*

郭宏亮，鄭紀(jì)偉，韓建國(guó)，王鵬來(lái)，張 磊

（1 徐州醫(yī)學(xué)院附屬徐州口腔醫(yī)院，江蘇 221002；2 徐州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院；3 徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科）

種植體植入牙槽骨的機(jī)械創(chuàng)傷使周圍骨組織釋放大量生長(zhǎng)因子，啟動(dòng)骨的修復(fù)，達(dá)到種植體周圍骨性融合。成骨細(xì)胞是骨改建過(guò)程中最重要的功能細(xì)胞，同時(shí)也是種植體—骨界面形成過(guò)程中最活躍的細(xì)胞之一。在這個(gè)過(guò)程中，多種生長(zhǎng)因子通過(guò)刺激成骨細(xì)胞的增殖和活性，對(duì)種植體周圍骨的生長(zhǎng)起著重要的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1) 就是其中重要的多肽生長(zhǎng)因子，能夠有效的促進(jìn)種植體的骨整合，是目前所知的作用最為復(fù)雜和多樣的生長(zhǎng)因子。在口腔微環(huán)境中，TGF-β1主要來(lái)源于炎癥細(xì)胞和成骨細(xì)胞，參與調(diào)控組織修復(fù)和重建，刺激成纖維細(xì)胞的擴(kuò)增和纖維連接蛋白和膠原的產(chǎn)生，抑制破骨細(xì)胞的形成和活性，并能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化。本研究選用鈦片模擬種植體，通過(guò)體外構(gòu)建成骨細(xì)胞模型，加入特定濃度TGF-β1刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。利用RT-PCR 的方法，檢測(cè)不同時(shí)間TGF-β1刺激后體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中I 型膠原蛋白(collagen-I,COL-I)的表達(dá)情況，探討TGF-β1對(duì)種植體表面成骨細(xì)胞增殖分化的影響，為臨床種植體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，解決種植體研究中關(guān)于組織相容性的關(guān)鍵問(wèn)題，有利于提高種植體的成功率，減少植入后的并發(fā)癥。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑 本實(shí)驗(yàn)成骨細(xì)胞來(lái)自美國(guó)ATCC中心的MC3T3-E1 成骨細(xì)胞系。鈦片來(lái)自瑞士Straumann 公司，直徑15mm，厚約1mm。FBS, PBS，0.25%胰酶來(lái)自Hyclone 公司；DMEM 培養(yǎng)基來(lái)自Giboco 公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-beta1 來(lái)自美國(guó)Pepro－TechInc 公司；地塞米松，抗壞血酸，β-甘油磷酸鈉來(lái)自美國(guó)Sigma 公司；RNAiso Reagent 試劑來(lái)自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自Fermentas 公司。GAPDH 引物及其它引物由上海生工合成，引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度見(jiàn)表1。

1.2 方法 （1）模擬體內(nèi)種植體專用鈦片制備及成骨細(xì)胞培養(yǎng)：鈦片使用噴砂機(jī)均勻噴砂處理3min，10 %鹽酸處理1min，去離子水清洗，5 %碳酸氫鈉中和，去離子水清洗3 次，高溫高壓消毒備用。MC3T3-E1 成骨細(xì)胞系用含100 g/L FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)。離心后1mL DMEM 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%～90%時(shí)可行傳代，需棄去舊培養(yǎng)液，用PBS 清洗2～3 次，每次2mL。棄去PBS 清洗液后，加0.25%胰酶0.6mL 進(jìn)行消化，5%CO2培養(yǎng)箱靜置5～10min。加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，每瓶加入5mL 培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。將處理好的模擬體內(nèi)種植體專用鈦片置于6 孔培養(yǎng)板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化。DMEM 培養(yǎng)基混懸單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個(gè)/mL，取200μL 滴種于處理好的模擬體內(nèi)種植體專用鈦片表面，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4～6 小時(shí)后再加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基5mL, 放入5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 小時(shí)后細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)基1 次，加入50ng 抗壞血酸+10mM β-甘油酸鈉+5nM 地塞米松，每3 天換液1 次，以后按常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。（2）TGF-β1刺激：實(shí)驗(yàn)分為2 個(gè)濃度刺激組（0.5ng/mL 和10ng/mL）及1 個(gè)對(duì)照組，按每孔1mL 即1×105個(gè)細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，分別加入0.5ng/mL 和10ng/mL TGF-β1刺激細(xì)胞。對(duì)照組不加TGF-β1刺激。分別收集培養(yǎng)第2d，5d，7d 的細(xì)胞。通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間成骨細(xì)胞中COL-ImRNA 表達(dá)情況。RNA 提?。涸斠?jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。（3）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)：在Microtube管中配置模板RNA/引物混合液，得到的cDNA 溶液用于PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)根據(jù)PUBMED 檢索到的相應(yīng)的cDNA 序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，全部引物由上海生工生物工程公司合成。所有溶液融化后輕輕震蕩并短暫離心，置冰上。PCR 反 應(yīng) 體 系 為10×PCR Buffer 5μL，25mmol/L MgCl23μL，10mmol/LdNTP 1μL，Primer11μL，Primer 21μL，cDNA3μL，5U/μL Taq DNA polymeras,0.8μL，Sterilized ddH2O 35.2μL。PCR 條 件：94℃預(yù) 變 性4min，92℃變性40sec，按照表1 中所列出的最佳退火溫度退火45sec，72℃延伸1min40sec，此為一個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)：最后72℃延伸15min。（每樣本重復(fù)三管）。PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取10μL 反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，測(cè)量和計(jì)算各組的擴(kuò)增帶與內(nèi)參光密度的比值，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用q 檢驗(yàn)；3 組間及3 組以上比較應(yīng)用方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 成骨細(xì)胞鋪板24 h 后，大部分細(xì)胞貼壁呈紡錘形且?guī)в型黄?，?shù)目和長(zhǎng)短不一，且形成分散的集落，大小不等，融合后呈復(fù)層生長(zhǎng)。

2.2 成骨細(xì)胞和不同濃度TGF-β1刺激前后表達(dá)分別為內(nèi)參在不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中0.5ng/mL TGF-β1和10ng/mL TGF-β1刺激前后的表達(dá)對(duì)照情況，M 泳道為Marker (Gene Ruler 100bp DNA Ladder)，見(jiàn)圖1～2。

圖1 在不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中0.5ng/mL TGFβ1 刺激后的表達(dá)

圖2 在不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中10ng/mL TGF-β1刺激后的表達(dá)對(duì)照情況

2.3 不同濃度TGF-β1刺激后的COL-I 在不同時(shí)間培養(yǎng)成骨細(xì)胞表達(dá)對(duì)照 不同濃度TGF-β1對(duì)COL-I 表達(dá)影響的相對(duì)半量分析結(jié)果見(jiàn)表2。凝膠成像系統(tǒng)光密度分析后與對(duì)照組中COL-I 表達(dá)量相比，低濃度刺激組表達(dá)量略有升高，高濃度刺激組表達(dá)量略有降低。且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組內(nèi)及組間比較表達(dá)量變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3～5。

表2 TGF-β1 刺激體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞3 組不同時(shí)間COL-I 表達(dá)結(jié)果（s，n=9）

圖3 COL-I 不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中0.5ng/ml TGF-β1 刺激后的表達(dá)對(duì)照情況

圖4 COL-I 不同時(shí)間點(diǎn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中10ng/mL TGF-β1 刺激后的表達(dá)對(duì)照情況

圖5 COL-I 不同時(shí)間體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中TGF-β1 刺激后的表達(dá)對(duì)照

3 討論

膠原蛋白是骨組織的主要成份，已發(fā)現(xiàn)的骨及軟骨組織中存在15 種膠原成份，其中骨組織以I 型膠原蛋白為主。定向分化的成骨細(xì)胞增殖分化過(guò)程中，首先表達(dá)的I 型膠原蛋白合成在細(xì)胞增殖期占主導(dǎo)地位。是成骨細(xì)胞分化擴(kuò)增晚期、基質(zhì)形成早期的產(chǎn)物，是由成骨細(xì)胞分泌的重要骨基質(zhì)成分，在骨形成與礦化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]，一般認(rèn)為I 型膠原與早期成骨分化有關(guān)[2]。另外，I 型膠原蛋白是成骨細(xì)胞分泌基質(zhì)中主要的定型成分，是鈣鹽沉著和細(xì)胞附著的支架。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞穩(wěn)定增殖和分化，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)I 型膠原蛋白在細(xì)胞增殖期表達(dá)逐漸上升。這一結(jié)果符合成骨細(xì)胞增殖和分化的生理過(guò)程。任何細(xì)胞貼壁、附著和伸展都需要細(xì)胞外基質(zhì)，I 型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。Lynch 等將來(lái)自21d 齡大鼠顱頂骨的成骨細(xì)胞，培養(yǎng)在鋪有I 型膠原蛋白的培養(yǎng)板上。在最初增殖階段，塑料培養(yǎng)板上培養(yǎng)的細(xì)胞高水平表達(dá)纖粘連蛋白基因，卻在鋪有I 型膠原蛋白的培養(yǎng)板上培養(yǎng)的細(xì)胞中顯著下降。這說(shuō)明當(dāng)存在細(xì)胞外基質(zhì)時(shí)，與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基因表達(dá)就會(huì)降低。

骨組織是一個(gè)龐大的生長(zhǎng)因子庫(kù)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 最豐富的組織來(lái)源和儲(chǔ)存庫(kù)，骨組織中的TGF-β 主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生。體內(nèi)免疫組織化學(xué)和原位雜交研究表明，成骨細(xì)胞是骨組織中合成分泌TGF-β1的主要細(xì)胞，而TGF-β1主要由破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成。成骨細(xì)胞通過(guò)合成分泌TGF-β1，調(diào)節(jié)其自身增殖分化和代謝，從而調(diào)節(jié)骨代謝[3]。TGFβ1 與成骨細(xì)胞相互作用的機(jī)制目前尚不清楚，且關(guān)于體外成骨細(xì)胞合成分泌TGF-β1的研究較少。

生理狀態(tài)下，骨代謝包括吸收及形成兩個(gè)過(guò)程，兩者互相協(xié)調(diào)，維持機(jī)體骨代謝的平衡。這種平衡受骨局部微環(huán)境內(nèi)自分泌和（或）旁分泌的多種相關(guān)因子調(diào)節(jié)。研究表明[4]大多數(shù)影響骨吸收因子由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，并用于成骨細(xì)胞，使之分泌破骨細(xì)胞刺激因子和抑制因子，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活動(dòng)從而調(diào)節(jié)骨吸收。體內(nèi)研究表明[5]，成骨細(xì)胞本身可合成分泌TGFβ1并調(diào)節(jié)其活性；另一方面，在成骨細(xì)胞的細(xì)胞膜上有TGF-β1的特異性受體，TGF-β1可作用于成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)其增殖和分化，它們之間相互作用從而調(diào)節(jié)骨形成。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨細(xì)胞表達(dá)TGF-β1的強(qiáng)度和分泌的量增加。以第7 天左右最明顯并達(dá)到高峰，以后隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)反而下降?；罨腡GF-β1本身也可調(diào)節(jié)TGF-β1前體活性，使活化的TGF-β1量增多，活化后的TGF-β1反過(guò)來(lái)刺激成骨細(xì)胞的成熟、增殖和分化[6]，如此相互作用，形成良性循環(huán)。達(dá)到一定極限后，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)達(dá)到飽和密度停止增殖。成骨細(xì)胞隨新陳代謝而衰老凋亡，因而分泌TGF-β1量下降。本實(shí)驗(yàn)中TGF-β1在誘導(dǎo)組中第7 天左右達(dá)到高峰，比對(duì)照組高峰5天左右延后，且相對(duì)表達(dá)量顯著增加，符合以上的研究理論。

TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞的作用是非常復(fù)雜的。在相似的或不相同的研究模型中，得出了有爭(zhēng)議甚至相反的結(jié)果。目前TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用有3 種結(jié)論：(1)TGF-β1刺激成骨細(xì)胞增殖，但對(duì)成骨細(xì)胞的分化則沒(méi)有作用[7-12]。(2)TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞增殖無(wú)作用但刺激其分化[13-16]。(3)TGF-β1抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化[17-18]。導(dǎo)致這些不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素歸納起來(lái)包括：(1)細(xì)胞模型不同；(2)細(xì)胞來(lái)源、種屬、取材部位及所選動(dòng)物的發(fā)育階段不同；(3)培養(yǎng)條件不同，包括細(xì)胞分離傳代方法、細(xì)胞接種的密度大小、培養(yǎng)基的不同選擇、培養(yǎng)液中有無(wú)血清和其他相關(guān)因子存在等因素均可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(4)TGF-β1的來(lái)源與劑量。

本實(shí)驗(yàn)選取了I 型膠原蛋白通過(guò)體外構(gòu)建成骨細(xì)胞模型，利用RT-PCR 的方法檢測(cè)TGF-β1刺激前后不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，成骨細(xì)胞中I 型膠原蛋白的表達(dá)變化。得出以下結(jié)論：（1）所構(gòu)建的體外成骨細(xì)胞模型很好地模擬了體內(nèi)的成骨環(huán)境。（2）按模擬體內(nèi)種植體環(huán)境處理的鈦片與成骨細(xì)胞有良好組織相容性，可作為研究種植體與成骨細(xì)胞相結(jié)合的模型。（3）特定濃度TGF-β1可影響模擬體內(nèi)種植體的鈦片表面的成骨細(xì)胞的增殖和分化。低濃度(0.5ng/mL)的TGF-β1可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化；高濃度(10ng/mL)的TGF-β1可以抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化。

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