白念珠菌蛋白磷酸酯酶CaPph3和調(diào)節(jié)亞基CaPsy2在調(diào)節(jié)菌絲發(fā)育中的作用*

馮金榮，孫 偉，莊 重，朱丹丹，段義農(nóng)

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，江蘇 226001）

白念珠菌（Canidia albicans）是一種最重要的人體病原真菌。據(jù)統(tǒng)計臨床上大約10%的血液感染由它引起，導(dǎo)致的病死率高達(dá)40%[1]。目前白念珠菌仍是最主要的真菌病原，占真菌感染的50%以上[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌能以酵母態(tài)、假菌絲態(tài)和菌絲態(tài)3種形態(tài)存在[3]。相比較而言，其菌絲態(tài)細(xì)胞對人體危害更為嚴(yán)重，特別是當(dāng)患有艾滋病、惡性腫瘤等免疫力下降時，它能夠從酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)換，并能侵入患者內(nèi)部器官造成深部感染，嚴(yán)重時可導(dǎo)致患者死亡。所以，研究清楚白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換機制，對于其臨床治療和抗真菌藥物的開發(fā)都具有重要的意義[4]。

白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換是一個復(fù)雜的過程，受多種信號通路調(diào)控。最近研究表明白念珠菌的DNA損傷檢驗點與其菌絲發(fā)育過程有關(guān)，參與該途徑的重要蛋白激酶或蛋白磷酸酯酶的缺失或失活都會影響白念珠菌菌絲發(fā)育[5]。前期實驗中，我們已經(jīng)構(gòu)建了白念珠菌CaPPH3和CaPSY2缺失株以及它們的雙基因缺失株。初步發(fā)現(xiàn)它們對于多種遺傳毒性試劑敏感，但對于其是否參與調(diào)控菌絲發(fā)育過程還沒未明確。鑒于在釀酒酵母中，ScPsy2作為ScPph3的調(diào)節(jié)亞基而共同參與檢驗點修復(fù)過程[6]，本文中我們利用已構(gòu)建的CaPPH3和CaPSY2缺失株，以及它們的雙缺失株進(jìn)行菌絲發(fā)育實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺失株中加入遺傳毒性試劑HU和MMS后，會導(dǎo)致缺失株菌絲生成速度明顯加快，且移除這些遺傳毒性試劑后，缺失株的菌絲能夠進(jìn)一步伸長。結(jié)果說明CaPph3和CaPsy2對于白念珠菌極性生長有重要的作用，這為今后深入研究白念珠菌DNA損傷修復(fù)過程和菌絲發(fā)育間調(diào)控機制打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）菌株：白念珠菌野生型菌株RM1000由本實驗室保存，CaPPH3缺失株、CaPSY2缺失株及CaPPH3 CaPSY2雙缺失株由本實驗室構(gòu)建并保存。（2）主要試劑：羥基脲（HU）購自上海生工公司，甲基磺酸甲酯（MMS）購自 SIGMA 公司，順鉑（CP）購自大連美侖生物公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純等。

1.2 方法 （1）表型篩選試驗：參照Feng等[7]方法，將各待測菌株在液體YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)到穩(wěn)定期后，進(jìn)行倍比稀釋。然后取3μL 10-5稀釋的菌液，滴加在YPD平板及加有各種遺傳毒性試劑的YPD平板上。30℃培養(yǎng)2～3天后，觀察各菌株生長情況并拍照保存。（2）缺失株的存活率實驗：參照Wang等[8]方法，將各待測菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中于30℃過夜培養(yǎng)，第2天以1/10的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮YPD液體培養(yǎng)基中。30℃培養(yǎng)3小時后加入一定濃度的HU或MMS，處理1小時后取100 μL菌液，按上文方法進(jìn)行倍比稀釋。最后取100 μL 10-5稀釋的菌液涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2天后統(tǒng)計菌落數(shù)。實驗重復(fù)3次。（3）菌絲發(fā)育實驗：參照Zhao等[9]方法，將RM1000和各缺失株接種于YPD液體培養(yǎng)基中于30℃過夜培養(yǎng)，第2天以1/10的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮YPD培養(yǎng)基中。培養(yǎng)到對數(shù)期后，分別加入終濃度為50 mmol/L的HU和0.02%的MMS，處理4小時后收集菌體，用無菌水洗3次，然后加入新鮮YPD液體培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)，分別在0小時、2小時、4小時、6小時等時間點取樣，用顯微鏡觀察并拍照。本實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，最后取平均數(shù)，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CaPPH3和CaPSY2缺失株的表型鑒定 在前期實驗中，我們已經(jīng)分別構(gòu)建了CaPPH3缺失株（pph3/pph3）、CaPSY2缺失株（psy2/psy2）和 CaPPH3 CaPSY2雙基因缺失株（pph3/pph3 psy2/psy2），并對缺失株的表型進(jìn)行初篩。本文中對各缺失株在含有各種濃度的遺傳毒性試劑平板上的表型行進(jìn)一步鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.015%MMS平板上，CaPPH3缺失株與野生型菌株RM1000相比，表現(xiàn)出明顯的生長缺陷。而CaPSY2缺失株與CaPPH3缺失株的表型基本一致，也表型出對0.015%MMS敏感，且敏感程度基本與CaPPH3缺失株一致。而當(dāng)這2個基因共同缺失時，雙基因缺失株的表型與單基因缺失株類似，且對MMS的敏感程度也基本一致。而在0.02%MMS的平板上，各缺失株敏感程度進(jìn)一步加劇，但相互之間差異不大。類似現(xiàn)象在含有2 mmol/L CP、2.5 mmol/L CP、30 mmol/L HU 及 40 mmol/L HU 平板上都可觀察得到。預(yù)示著CaPph3和CaPsy2在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著類似的作用。

圖1 CaPPH3和CaPSY2缺失株的表型鑒定

2.2 CaPPH3和CaPSY2缺失株對遺傳毒性試劑的敏感程度測定 在釀酒酵母中，當(dāng)細(xì)胞遭受DNA損傷時，會激活檢驗點激酶修復(fù)損傷。當(dāng)胞內(nèi)的DNA損傷被修復(fù)后，ScPph3和ScPsy2可使檢驗點激酶ScRad53失活而使細(xì)胞周期恢復(fù)正常。但如這2個蛋白缺失，則會導(dǎo)致ScRad53不能被正常失活，使細(xì)胞周期不能恢復(fù)正常，從而導(dǎo)致缺失株存活率下降。本文利用獲得的白念珠菌各種缺失株，也進(jìn)行類似存活率檢測試驗。結(jié)果如圖2所示，與未處理組相比，用0.015%MMS處理各菌株時，野生型菌株的存活率約95%，而CaPPH3缺失株存活率僅有20%左右。CaPSY2缺失株和CaPPH3 CaPSY2雙基因缺失株的存活率也僅剩20%，與CaPPH3缺失株比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，（P＞0.05）。用0.02%MMS處理各菌株時，野生型菌株的存活率沒有明顯下降。而CaPPH3缺失株、CaPSY2缺失株和CaPPH3 CaPSY2雙基因缺失株的存活率進(jìn)一步下降，僅有7%。

圖2 MMS處理后各菌株的存活率

而如圖3所示，用30 mmol/L HU和40 mmol/L HU處理各菌株后，同樣會導(dǎo)致缺失株的存活率大幅度下降，而野生型基本無變化。說明在白念珠菌中CaPPH3和CaPSY2基因的缺失可能會導(dǎo)致缺失株不能完成DNA損傷修復(fù)過程，從而影響存活率。

圖3 HU處理后各菌株的存活率

2.3 CaPPH3和CaPSY2缺失株的菌絲發(fā)育實驗近期研究表明白念珠菌的極性生長與其DNA損傷修復(fù)過程有關(guān)，所以本實驗中進(jìn)一步研究CaPPH3和CaPSY2基因缺失后，對于白念珠菌菌絲生成的影響。如圖4所示，用終濃度為0.02%MMS處理各菌株，4小時后觀察其菌絲發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用MMS處理4小時后，野生型菌株RM1000還維持酵母態(tài)，而CaPPH3缺失株、CaPSY2缺失株，以及CaPPH3 CaPSY2雙缺失株已出芽形成一定長度的菌絲。而移除MMS后，野生型菌株逐漸形成菌絲并延長，到6小時后其菌絲不再延長，而是逐漸出芽，在菌絲頂端形成酵母態(tài)細(xì)胞。但在CaPPH3缺失株中移除MMS后，缺失株的菌絲逐漸延長，直至8小時時缺失株仍維持菌絲態(tài)。而CaPSY2缺失株，以及CaPPH3 CaPSY2雙缺失株的菌絲生成情況與CaPPH3缺失株基本類似。從而說明在MMS誘導(dǎo)條件下，蛋白磷酸酯酶CaPph3和CaPsy2的缺失會促進(jìn)白念珠菌的菌絲生成。

圖4 MMS處理后各菌株的菌絲生成情況

采用同樣的方法，用終濃度為50 mmol/L的HU處理4小時后觀察各菌株的菌絲發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理前后，野生型菌株基本不形成明顯的菌絲。而在CaPPH3缺失株、CaPSY2缺失株及CaPPH3 CaPSY2雙缺失株中，移除HU后各缺失株均逐漸形成菌絲，且隨著時間延長缺失株的菌絲也逐漸伸長。結(jié)果說明HU誘導(dǎo)條件下，CaPph3和CaPsy2缺失也會促進(jìn)白念珠菌菌絲生成。

圖5 HU處理后各菌株的菌絲生成情況

3 討 論

本實驗中我們利用所獲得的白念珠菌CaPPH3缺失株、CaPSY2缺失株及CaPPH3 CaPSY2雙缺失株進(jìn)行表型鑒定和菌絲發(fā)育實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaPPH3和CaPSY2單獨缺失或共同缺失，均會導(dǎo)致缺失株對各類遺傳毒性試劑敏感，且它們敏感程度基本一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過HU或MMS處理后CaPPH3缺失株、CaPSY2缺失株及CaPPH3 CaPSY2雙缺失株存活率均明顯下降，且下降程度一致。研究還發(fā)現(xiàn)，在遺傳毒性試劑HU和MMS誘導(dǎo)條件下，CaPPH3和CaPSY2單獨或共同缺失后均會促進(jìn)缺失株菌絲的發(fā)育，且各缺失株的菌絲發(fā)育情況基本一致。說明CaPph3和CaPsy2共同參與DNA損傷修復(fù)過程，并調(diào)控白念珠菌菌絲發(fā)育過程。

在釀酒酵母中，蛋白磷酸酯酶ScPph3存在兩個調(diào)節(jié)亞基即ScPsy2和ScPsy4，它們能組成復(fù)合體而調(diào)節(jié)其最重要的檢驗點激酶ScRad53活性。而在白念珠菌中，目前只鑒定出CaPph3可能調(diào)節(jié)亞基CaPsy2，且發(fā)現(xiàn)它與檢驗點CaRad53間確實存在相互作用，但對于其是否存在另一個與ScPsy4相對應(yīng)的調(diào)節(jié)亞基還未定論。近期實驗發(fā)現(xiàn)，一個白念珠菌可能存在的CaPsy4蛋白，通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)它與CaPph3及CaPsy2間存在相互作用。所以推測在白念珠菌中，CaPph3及CaPsy2借助于可能存在的CaPsy4橋接作用，組成復(fù)合體共同參與DNA損傷修復(fù)過程，調(diào)控某些檢驗點激酶的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)菌絲發(fā)育過程。本實驗發(fā)現(xiàn)，CaPph3和CaPsy2在調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)過程中，和菌絲發(fā)育過程方面幾乎具有類似的作用，進(jìn)一步驗證我們的推測。所以本研究成果對于今后進(jìn)一步研究磷酸酯酶CaPph3復(fù)合體在菌絲發(fā)育方面的作用具有重要的意義。

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