高脂膳食對雄性肥胖大鼠腎周脂肪水通道蛋白7表達的影響*

趙健亞 ，王曉珂，劉天娥 ，肖 靜

（1南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，江蘇226019；2南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)醫(yī)學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)教研室）

水通道蛋白（aquaporin,AQP）是一類對水具特殊通透性的跨膜蛋白，其亞型AQP3、7、9、10同時對甘油具有通透性，其中AQP7在脂肪組織中表達豐富。動物實驗發(fā)現(xiàn)AQP7基因敲除小鼠脂肪細胞甘油輸出能力受損，可能與肥胖及高脂膳食誘導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)[1-3]。而人類實驗則結(jié)論不一，有文獻報道肥胖人群脂肪組織AQP7表達減少[4-6]，也有實驗觀察到肥胖患者出現(xiàn)AQP7代償性增加[7-8]。這可能與研究涉及的是皮下脂肪還是內(nèi)臟脂肪的脂肪組織部位不同以及肥胖嚴(yán)重程度不同有關(guān)。本研究擬采用高脂膳食喂養(yǎng)的方式建立與人類肥胖相似度很高的大鼠肥胖模型（dietary induced obesity,DIO），觀察8周和20周不同肥胖病程大鼠內(nèi)臟脂肪（腎周脂肪）組織AQP7 mRNA表達的變化情況，并探討肥胖發(fā)生的作用機理。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗動物：健康SD大鼠48只，雄性，體重110～130g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。（2）飼料：基礎(chǔ)飼料和高脂飼料（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司），三大供能營養(yǎng)素質(zhì)量比和供能比見表1。（3）主要試劑：血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒（羅氏診斷有限公司）；Trizol（Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄和Real-Time PCR試劑盒（Takara公司）。

表1 基礎(chǔ)飼料和高脂飼料主要成分質(zhì)量比和供能比（g/100g，%）

1.2 方法（1）建立DIO大鼠模型：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機分為兩組，正常對照組（C組）12只，喂飼基礎(chǔ)飼料，其余36只喂高脂飼料。自由進食、飲水，每周固定時間稱大鼠體重。第8周時，高脂喂養(yǎng)組按體重大于C組平均體重+1.96倍標(biāo)準(zhǔn)差篩選出DIO模型大鼠（DIO組），其余大鼠舍棄。隨機抽取C組和DIO組大鼠各6只取材，其余繼續(xù)喂養(yǎng)至20周全部處死。（2）樣品采集與檢測：大鼠取材前禁食不禁水12小時，測量鼻肛體長，計算Lee’s指數(shù)=麻醉后分離股動脈取血，3 000r/m，離心10min，分離血清待測。血脂在AU5831全自動生化分析儀檢測。迅速分離大鼠肝臟、腎周脂肪和睪周脂肪組織稱重，計算肝/體比(%)=肝臟重量(g)×100%/體重(g)，脂/體比(%)=[腎周脂肪重量(g)+睪周脂肪重量(g)]×100%/體重(g)。取部分腎周脂肪組織，按試劑盒說明書用Trizol法提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。引物由Invitrogen公司合成，βactin(200 bp)：上游引物 5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’，下游引物：5’-CTCCGGAGTCCATCACAATG-3’；AQP7(200 bp)：上游引物 5’-GGAGTTCCTGAGTACCTATG-3’，下游引物：5’-GGCCTAGTGCACAGTTAGTG-3’。反應(yīng)體系在羅氏LC-480實時熒光定量PCR儀上進行，以2-△△cT法[9]表示高脂組相對于基礎(chǔ)飼料對照組的變化倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量指標(biāo)數(shù)據(jù)以±s表示，進行t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高脂膳食對大鼠體重、Lee’s指數(shù)、肝/體比和脂/體比的影響 8周末，高脂飼料喂養(yǎng)組共有14只大鼠被判定為DIO大鼠（成模率為38.9%）。由表2可知：高脂喂養(yǎng)8周，大鼠體重、Lee’s指數(shù)、肝/體比和脂/體比明顯高于基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或 P＜0.05），喂養(yǎng)至 20周，肥胖程度增加，指標(biāo)均進一步明顯增高（P＜0.01）。

表 2 兩組大鼠體重、Lee’s指數(shù)、肝/體比和脂/體比（±s）

表 2 兩組大鼠體重、Lee’s指數(shù)、肝/體比和脂/體比（±s）

注：與 C 組同期相比，*P＜0.05，**P＜0.01

20周C組 DIO組 C組 DIO組n 6 6 6 8 8周體重(g) 453.28±36.02 561.75±26.26** 586.61±25.07 733.22±22.31**Lee's指數(shù) 292.68±3.62 299.08±4.70* 291.34±3.20 314.20±5.15**肝/體比(%) 2.67±0.16 2.85±0.06* 2.55±0.20 3.00±0.11**脂/體比(%) 3.34±0.29 6.47±0.48** 4.42±0.48 7.51±0.93**

2.2 高脂膳食對大鼠血脂的影響 高脂喂養(yǎng)8周時，大鼠血清TG含量明顯高于C組（P＜0.01），兩組間TC、HDL-C和LDL-C含量沒有明顯差異，見圖1。繼續(xù)喂養(yǎng)至20周，血清TC、TG和LDL-C水平均明顯升高（P＜0.01或 P＜0.05），HDL-C 含量無變化，見圖2。

圖1 高脂喂養(yǎng)8周大鼠血脂水平

圖2 高脂喂養(yǎng)20周大鼠血脂水平

2.3 高脂膳食對大鼠腎周脂肪AQP7 mRNA表達的影響 與基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)組相比，高脂膳食喂養(yǎng)8周后，大鼠腎周脂肪組織AQP7 mRNA表達明顯上調(diào)[（2.25±0.18）vs（1.05±0.19）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而喂養(yǎng)至20周時則明顯下調(diào)[（0.52±0.11）vs（1.02±0.21）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3。

圖3 大鼠腎周脂肪AQP7 mRNA水平

3 討 論

高脂高能膳食誘導(dǎo)的動物肥胖模型與人類肥胖最具相似性。Levin等[10]發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)后部分大鼠發(fā)生肥胖（DIO大鼠），部分則不發(fā)生肥胖（飲食誘導(dǎo)肥胖抵抗大鼠），同樣人群也存在類似不同肥胖易感現(xiàn)象[11]。以往有關(guān)AQP7與肥胖發(fā)生關(guān)系的動物研究，多采用AQP7基因敲除小鼠，也未對肥胖抵抗現(xiàn)象加以關(guān)注，因此本實驗首先篩選出DIO大鼠模型用于研究。高脂喂養(yǎng)8周后，DIO大鼠體重、Lee’s指數(shù)、肝/體比、脂/體比和血清TC含量明顯高于基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)組（P＜0.01或P＜0.05），表明模型構(gòu)建成功。繼續(xù)喂養(yǎng)20周后，上述指標(biāo)明顯增高（P＜0.01），血清 TC（P＜0.01）和 LDL-C 水平（P＜0.05）也明顯升高，表示肥胖程度增加。

白色脂肪組織是最大的能量儲存器官，在維持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)和能量平衡中發(fā)揮重要作用，因此與肥胖發(fā)生密切相關(guān)。Kishida等[12]用小干擾RNA敲除3T3-L1脂肪細胞AQP7，Maeda等[1]建立AQP7基因敲除小鼠模型均證明AQP7是脂肪細胞中的甘油通道，AQP7基因缺陷導(dǎo)致甘油釋放受阻。隨后又有研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，AQP7缺陷可能與肥胖發(fā)生有關(guān)。Marrades等[4]對人類研究發(fā)現(xiàn)，6名男性肥胖青年（BMI=35.0±1.1 kg/m2）皮下脂肪AQP7 mRNA表達低于6名正常體重者（BMI=23.2±0.4 kg/m2）。而對肥胖婦女一項研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重肥胖者（BMI=44.3-57.5 kg/m2）皮下脂肪AQP7 mRNA表達比正常組（BMI=22.4-24.0 kg/m2）和非嚴(yán)重肥胖組（BMI=27.4-33.3 kg/m2）低，后兩組中表達無差異[5]。該研究還發(fā)現(xiàn)不同性別非嚴(yán)重肥胖者表達無差異（結(jié)果未發(fā)表）。Rodriguez等[6]發(fā)現(xiàn)與正常體重者相比，肥胖患者（BMI≥30 kg/m2，同時男性體脂≥25%，女性體脂≥35%）皮下脂肪AQP7 mRNA和蛋白表達減少。

上述研究結(jié)果僅涉及皮下脂肪組織，推測肥胖人群存在AQP7表達下調(diào)或功能缺陷，但內(nèi)臟脂肪可能對肥胖和胰島素抵抗的敏感性更高[14]。Catalan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖婦女（BMI≥30 kg/m2，體脂≥35%）內(nèi)臟脂肪AQP7 mRNA水平有增高趨勢。袁振芳等[8]也證明中國肥胖婦女（BMI=28.1±3.1 kg/m2）內(nèi)臟脂肪AQP7蛋白表達水平高于皮下脂肪，比正常組有升高趨勢。這2個研究結(jié)果推測可能是肥胖者為了減少脂肪細胞體積和脂肪重量，釋放出更多甘油而引起的AQP7代償性增加[7-8]。

本實驗取腎周脂肪組織作為內(nèi)臟脂肪代表樣品，發(fā)現(xiàn)高脂膳食喂養(yǎng)8周后，大鼠脂肪AQP7 mRNA表達比基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)組上調(diào)了115%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），實驗結(jié)果與 Catalan[7]和袁振芳等[8]報道類似。另外目前僅有少量動物實驗報道肥胖小鼠皮下脂肪AQP7 mRNA上調(diào)[12]，這種代償性的增加可能標(biāo)志著肥胖和胰島素抵抗的啟動。而高脂繼續(xù)喂養(yǎng)至20周，隨著肥胖程度增加，腎周脂肪AQP7 mRNA表達比正常下降了49%，這一結(jié)果與Ceperuelo-Mallafre等[5]報道的嚴(yán)重肥胖者皮下脂肪AQP7 mRNA表達比正常組和非嚴(yán)重肥胖組低是一致的，由此證明AQP7與不同程度肥胖間可能存在不同的作用機制。

本實驗結(jié)果顯示，高脂膳食誘導(dǎo)的雄性肥胖大鼠腎周脂肪組織AQP7 mRNA的表達，在肥胖早期呈現(xiàn)代償性上調(diào)，而肥胖嚴(yán)重到一定程度則出現(xiàn)下調(diào)。接下來有必要進一步研究其發(fā)生機制，為研制以AQP7為靶點的新型減肥藥物提供依據(jù)。

[1]Maeda N,Funahashi T,Hibuse T,et al.Adaptation to fasting by glycerol transport through aquaporin 7 in adipose tissue[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(51):17801-17806.

[2]Hibuse T,Maeda N,Funahashi T,et al.Aquaporin 7 deficiency is associated with development of obesity through activation of adipose glycerol kinase[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(31):10993-10998.

[3]Macdougald OA,Burant CF.Obesity and metabolic perturbations after loss of aquaporin 7,the adipose glycerol transporter[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(31):10759-10760.

[4]Marrades MP,Milagro FI,Martinez JA,et al.Differential expression of aquaporin 7 in adipose tissue of lean and obese high fat consumers[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,339(3):785-789.

[5]Ceperuelo-Mallafre V,Miranda M,Chacon MR,et al.Adipose tissue expression of the glycerol channel aquaporin-7 gene is altered in severe obesity but not in type 2 diabetes[J].J Clin Endocrinol Metab,2007,92(9):3640-3645.

[6]Rodriguez A,Catalan V,Gomez-Ambrosi J,et al.Insulinand leptin-mediated control of aquaglyceroporins in human adipocytes and hepatocytes is mediated via the PI3K/Akt/mTOR signaling cascade[J].J Clin Endocrinol Metab,2011,96(4):E586-E597.

[7]Catalan V,Gomez-Ambrosi J,Pastor C,et al.Influence of morbid obesity and insulin resistance on gene expression levels of AQP7 in visceral adipose tissue and AQP9 in liver[J].Obes Surg,2008,18(6):695-701.

[8]袁振芳,張浩,趙妍,等.肥胖女性與體重正常女性內(nèi)臟和皮下脂肪組織水通道蛋白7表達水平的比較[J].中國糖尿病雜志,2010,18(10):735-739.

[9]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[10]Levin BE,Triscari J,Sullivan AC.Metabolic features of diet-induced obesity without hyperphagia in young rats[J].Am J Physiol,1986,251(3 Pt 2):R433-R440.

[11]Bouchard C,Tremblay A.Genetic influences on the response of body fat and fat distribution to positive and negative energy balances in human identical twins[J].J Nutr,1997,127(5 Suppl):943S-947S.

[12]Kishida K,Kuriyama H,Funahashi T,et al.Aquaporin adipose,a putative glycerol channel in adipocytes[J].J Biol Chem,2000,275(27):20896-20902.

[13]Miranda M,Ceperuelo-Mallafre V,Lecube A,et al.Gene expression of paired abdominal adipose AQP7 and liver AQP9 in patients with morbid obesity:relationship with glucose abnormalities[J].Metabolism,2009,58(12):1762-1768.

[14]Wajchenberg BL.Subcutaneous and visceral adipose tissue:their relation to the metabolic syndrome[J].Endocr Rev,2000,21(6):697-738.