HPLC法測定不同產(chǎn)地金蕎麥超微粉（-）-表兒茶素含量

王 航，王洪鴿，盧亞藝，唐 棣，吉莉莉，湯 承＊

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.四川省獸藥監(jiān)察所，四川成都610041）

金蕎麥為蓼科植物金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）的干燥根莖，味微辛、澀，性涼，具有清熱解毒、排膿祛瘀之功效，臨床用于治療肺膿腫、麻疹肺炎、扁桃體周圍膿腫［1］。其有效成分為原花色素類縮合鞣質(zhì)及其前體的混合物，包括（-）- 表兒茶素［（-）-epicatechin］及其衍生物的單體、二聚體和多聚體［2］。金蕎麥乙醇提取物為一類含原花色素的縮合性單寧混合物，主要由（-）-表兒茶素及其二聚體組成，其中（-）- 表兒茶素單元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占65% ～70%［3］。金蕎麥醇提物對豬胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌有較強(qiáng)的抑菌效果，而對副豬嗜血桿菌、多殺性巴桿菌、大腸埃希菌的抑菌效果相對較弱［4-9］。金蕎麥醇提物可明顯抑制C57／BL6小鼠Lewis肺癌生長［10］，有促進(jìn)白細(xì)胞上升，保護(hù)粒細(xì)胞的作用［8］；金蕎麥醇提物也可以對雞脾淋巴細(xì)胞的增殖活性呈明顯的時效及量效關(guān)系［11］。何美珊等［12］對不同產(chǎn)地金蕎麥飲片醇提物中（-）-表兒茶素含量進(jìn)行測定，表明金蕎麥根具有免疫調(diào)節(jié)活性。但還未見不同產(chǎn)地金蕎麥超微粉醇提物中（-）-表兒茶素的含量進(jìn)行測定的報道，本研究旨在了解我國不同產(chǎn)地金蕎麥中（-）-表兒茶素含量是否存在差異，為金蕎麥相關(guān)制劑的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LC-10AT 型高效液相色譜儀日本島津公司產(chǎn)品，CPA2250 型電子天平，德國Sartorius公司產(chǎn)品，WK-150 型小型超微粉碎機(jī)，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品，SH13-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 乙腈、乙醇、磷酸均為分析純；（-）-表兒茶素對照品，成都瑞芬思生物科技有限公司產(chǎn)品，批號B-020-111023，HPLC≥98%。

金蕎麥8個金蕎麥飲片待檢樣本分別來自四川（批號120510）、內(nèi)蒙古（批號120909）、云南（批號120920）、貴州（批號120602）、江蘇（批號120703）、江西（批號120512）、浙江（批號120701）、安徽（批號120601）。

1.2 方法

1.2.1 金蕎麥超微粉的制備 將各產(chǎn)地金蕎麥飲片通過小型超微粉碎機(jī)粉碎，過400目篩，制成粒徑在0.75nm 以下的超微粉。

1.2.2 （-）-表兒茶素的提取 （-）-表兒茶素的提取參考文獻(xiàn)［12-15］提取金蕎麥超微粉中的（-）-表兒茶素的方法。分別精確稱取不同產(chǎn)地的金蕎麥超微粉各2.5g于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入500mL／L乙醇50mL，密封，稱定總重量，隨后超聲波處理30 min，室溫過夜，加熱回流1h，用500 mL／L乙醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，四層紗布濾過。精密吸取濾液25mL，減壓濃縮至完全干燥，殘?jiān)尤?0mL乙腈-水（1∶9）分次洗滌，并移至10mL量瓶中，10 000r／min離心5min，取上清液5mL備用。

1.2.3 高效液相色譜測定表兒茶素的含量 色譜條件色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［12］，色譜柱為Kromasil C 柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相為水（用磷酸調(diào)pH 至3.00±0.02）-乙腈（92∶8），流量為1.0mL／min，柱溫為35℃，檢測波長為278nm，進(jìn)樣量為10μL。

1.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取（-）-表兒茶素對照品3.52 mg，加入乙腈-水（1∶9）制成含（-）-表兒茶素35.2μg／mL的溶液。

1.2.5 線性關(guān)系測定 用乙腈-水（1∶9）將取1.2.4中的對照品溶液2 倍稀釋成0.55μg／mL～1.76μg／mL的對照品溶液。以（-）-表兒茶素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取產(chǎn)地為四川的金蕎麥超微粉6份，每份2.5g，按1.2.2方法提取，按1.2.3色譜條件測定。計(jì)算（-）-表兒茶素含量。

1.2.7 精密度測定試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為1.76 μg／mL的（-）-表兒茶素對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，按1.2.3色譜條件測定，計(jì)算平均峰面積。

1.2.8 回收率試驗(yàn)方法 采用加樣回收法，取已知含量的金養(yǎng)麥超微粉（產(chǎn)地四川）6份，每份1.25g，分別精密加入6.0μg／mL（-）-表兒茶素對照品溶液1mL。按1.2.2 方法提取（-）-表兒茶素，按1.2.3色譜條件測定，計(jì)算其峰面積。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系測定結(jié)果

回歸方程為Y＝519 812.36X＋2 018.12，r＝0.999 2（n＝5），X表示（-）-表兒茶素質(zhì)量濃度（μg／mL），Y為峰面 積，（-）-表兒茶素在0.55 μg／mL～17.6μg／mL 與峰面積線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品樣品的色譜圖見圖1。圖中x軸表示出峰時間，y軸表示電信號響應(yīng)值（mv）。

圖1 （-）-表兒茶素HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of（-）-epicatechin

2.2 精密度測定結(jié)果

測得（-）- 表兒茶素峰面積平均值為913 360.3mAU＊s，RSD 為0.74%。表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

（-）-表兒茶素含量平均值為7.419 8μg／g，RSD 為1.70%，表明該方法重復(fù)性好。

2.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明（-）-表兒茶素平均回收率93.86%，RSD 為3.10%。表明此方法檢測（-）-表兒茶素含量可靠、穩(wěn)定。

2.5 樣品含量測定

8個產(chǎn)地金麥超微粉（-）-表兒茶素含量結(jié)果見表1。

表1 金蕎麥超微粉中（-）-表兒茶素含量（μg／g，n＝3）Table 1 Determination of（-）-epicatechin in Fagopyrum dibotrys（μg／g，n＝3）

3 討論

中藥材在長期特定的氣候條件和土壤條件等環(huán)境中生長，其有效成分含量也大不相同，本試驗(yàn)最終樣品含量結(jié)果表明不同產(chǎn)地金蕎麥中（-）-表兒茶素含量確有不同，（-）-表兒茶素含量也受到不同產(chǎn)地等因素的影響。

本試驗(yàn)中所得到到金蕎麥超微粉醇提物中的（-）-表兒茶素含量在6.45μg／g～8.81μg／g之間，低于金蕎麥飲片醇提物中所檢測到的含量［12］。分析其原因有以下幾點(diǎn)：一是因（-）-表兒茶素對溫度敏感，在金蕎麥超微粉的制備過程中溫度升高，極易使（-）-表兒茶素氧化分解［16］。二是制備超微粉過程中因超微粉粒徑過小，與空氣接觸面積變大，使有效成分極易與空氣接觸導(dǎo)致氧化［17］。

目前，金蕎麥和其他大部分中藥飲片在生產(chǎn)、流通、使用中很難準(zhǔn)確分析、定量其中的有效成分，嚴(yán)重影響了中醫(yī)臨床用藥的安全、有效?，F(xiàn)代高效液相色譜技術(shù)能快速、準(zhǔn)確的檢測微量物質(zhì)的含量，為中藥成分的鑒別、定量提供快速、準(zhǔn)確的檢測手段。為以（-）-表兒茶素含量的多少來制定金蕎麥超微粉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：69，89，109，52。附錄31，附錄32.

［2］邵 萌，楊躍輝，高慧媛.金蕎麥的化學(xué)成分研究［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，22（2）：100-102.

［3］Yao R C.Activity constituents of antitumor fromFagapyrum cymosum［J］.Acta Bot Yunnan，1989，11（2）：215-218

［4］周玉巖，喬紅杰.金蕎麥提取物體外抗菌活性研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2009（5）：44-46.

［5］包 鵬，張向榮，周曉棉，等.金蕎麥提取物的藥效學(xué)研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2009，11（7）：36-37.

［6］盛華剛，朱立俏，林桂濤.金蕎麥的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2011，4（2）：26-29.

［7］汪春彥，吳常青，江 勤，等.金蕎麥對克雷伯桿菌肺炎大鼠心肌損傷中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，46（1）：44-48.

［8］張永仙，王 權(quán).金蕎麥有效成分的抗菌抗感染作用［J］.云南畜牧獸醫(yī)，1996（2）：22.

［9］程友斌，潘洪林.金蕎麥抗炎活性部位篩選研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（9）：2219-2220.

［10］陳曉鋒，顧振綸，楊海華，等.金蕎麥Fr4對小鼠lewis肺癌細(xì)胞MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，25（3）：383.

［11］喬紅杰，王貴平，李春玲.金蕎麥根提取物對雞脾淋巴細(xì)胞活性影響的血清藥理學(xué)研究［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（3）：44-48.

［12］何美珊，錢炳輝.HPLC 法測定金蕎麥中（-）-表兒茶素含量［J］.中草藥，2005（3）：36.

［13］陳 煦.HPLC法測定金蕎麥片中原兒茶酸和表兒茶素的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（4）：641-643

［14］Song R，Cheng Y，Tian Y.A validated solid-phase extraction HPLC method for the simultaneous determination of gallic acid，catechin and epicatechin in rhubarb decoction［J］.Chinese J Natural Med，2012，10（4）：275-278.

［15］潘金火，嚴(yán)國俊，盧 歡.反相HPLC測定金蕎麥藥材和飲片中表兒茶素的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2010，45（14）：1092-1094.

［16］楊 莉，丁安偉，張 麗，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選金養(yǎng)麥的提取工藝［J］.中國藥業(yè)，2009，18（1）：32-33.

［17］欒 梅，呂敬慈.金蕎麥超臨界CO2流體的萃取工藝［J］.上海大學(xué)學(xué)報，2008，14（3）：328-330.