絲狀支原體山羊亞種假定可變表面脂蛋白基因的克隆及原核表達(dá)

徐春光，高明華，趙艷芳，郝瑞霞，郝永清＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)內(nèi)蒙古重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.呼倫貝爾學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021008；3.呼倫貝爾市鄂溫克旗農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000）

絲狀支原體山羊亞種 （Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc）是絲狀支原體簇（Mycoplasma mycoides cluster，Mm cluster）的成員，是引起山羊支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG）的主要病原體之一。Mm cluster由5個(gè)遺傳學(xué)上和血清學(xué)關(guān)系相近的重要的反芻獸病原支原體組成，除 Mmc以外，還包括絲狀支原體絲狀亞種小菌落型（Mycopalsam mycoides subsp.mycoides Small colony，MmmSC）、山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp）、山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolumsubsp.capricolum，Mcc）和李奇氏支原體（Mycoplasma leachii，Ml）［1］。

支原體的可變表面脂蛋白一般指由于基因的缺失、倒置、插入、重排、重組等突變導(dǎo)致抗原的相對(duì)分子質(zhì)量大小和相發(fā)生高頻變異的表膜蛋白［2］。在支原體的基因組中，通常多個(gè)編碼可變表面脂蛋白的基因成簇排列并高度同源。這些蛋白氨基端的信號(hào)肽與跨膜區(qū)和羧基端的部分序列高度保守，而羧基端的可變區(qū)通常具有重復(fù)序列。研究者們認(rèn)為支原體在感染的不同階段通過表面可變蛋白加強(qiáng)定殖和適應(yīng)宿主的組織環(huán)境?？勺儽砻嬷鞍讓?duì)于支原體的抗原性、免疫調(diào)節(jié)和底物結(jié)合等有著重要的意義［3－5］。在 Mm cluster 中，已 經(jīng) 有 研 究 證 明MmmSC的vmm基因和Mcc的vmc基因編碼表達(dá)大小和相變異的表面脂蛋白，vmm和vmc在MmmSC和Mcc的自然感染過程中都進(jìn)行表達(dá)，利用生物工程技術(shù)獲得的vmm的原核重組蛋白具有免疫原性，能夠誘發(fā)體液免疫反應(yīng)［6－8］。對(duì) Ml的全基因組序列信息研究分析發(fā)現(xiàn)，在其基因組上存在可變表面脂蛋白vlc基因簇［9］。通過 Mmc 95010株和GM12株的比較基因組學(xué)研究推測(cè)95010株的基因簇（MLC－9030～MLC－9050、MLC－9070～MLC－9090）和 GM12 株 的 的 基 因 簇 （MMCAP2－0900～MMCAP2－0904）為可變脂蛋白基因［10］。

為進(jìn)一步研究支原體可變表面脂蛋白的功能和絲狀支原體山羊亞種的致病機(jī)制，本研究對(duì)從絲狀支原體山羊亞種PG3標(biāo)準(zhǔn)株克隆到的一個(gè)可變表面脂蛋白的全長(zhǎng)基因及其預(yù)測(cè)氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)發(fā)育研究。并將編碼成熟肽的基因序列插入表達(dá)載體pET－32a（＋），構(gòu)建大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 絲狀支原體山羊亞種PG3標(biāo)準(zhǔn)株 （Mycoplasma mycoides subsp.capri str.PG3）、表達(dá)質(zhì)粒pET－32a（＋）為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室在－80℃下冷凍保藏；兔抗絲狀支原體山羊亞種PG3標(biāo)準(zhǔn)株高免血清由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 室 自制并保 藏；Escherichia coli （E.coli）DH5α、E.coli BL21（DE3）為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pMD19－T simple vector為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑和儀器 質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；支原體基因組DNA提取試劑盒為Biomiga公司產(chǎn)品；蛋白電泳試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（低）為寶生物工程有限公司產(chǎn)品，雙色預(yù)染寬分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為Introgen公司產(chǎn)品；IPTG、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL1 500、Es TaqDNA聚合酶為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；His鎳柱為GE Healthcare公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒為GE Healthcare公司產(chǎn)品，其他所用試劑均為分析純。PCR擴(kuò)增儀、UVP凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)BIO－RAD公司產(chǎn)品；核酸電泳儀、蛋白電泳儀為北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白編碼基因的擴(kuò)增與克隆

1.2.1.1 Mmc str.PG3菌株的培養(yǎng) 以1∶10的比例將Mmc str.PG3接種到改良的Hayflick’s液體培養(yǎng)基中，并于體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中、37℃條件下培養(yǎng)3d。培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。

1.2.1.2 基因組DNA的小量提取 用高速離心機(jī)以15 000r／min、4℃離心收集菌體。參照支原體基因組DNA提取試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行基因組DNA的小量提取。

1.2.1.3 假定可變表面蛋白編碼基因的PCR擴(kuò)增與克隆 根據(jù)絲狀支原體山羊亞種95010株預(yù)測(cè)的可變脂蛋白基因 MLC－9030～MLC－9050、MLC－9070～MLC－9090，GM12株的可變表面脂蛋白基因MMCAP2－0900～MMCAP2－0904的堿基序列比較設(shè)計(jì)測(cè)序用引物如下：Primer1：5′－ACCAAAAGATAAATAACCAATTGTAAAGG－3′；Primer2：5′－TGGTAAGGGCTTATCTGGAACATT－3′。PCR反應(yīng)采用50μL體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物純化回收克隆于pMD19－T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，菌液PCR鑒定，選取陽性克隆測(cè)序，測(cè)序工作由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 假定可變表面脂蛋白編碼基因序列與其推測(cè)的氨基酸序列分析 用NCBI ORF Finder尋找和確定所測(cè)基因序列的 ORF（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）。將所測(cè)基因序列用DNAStar v 7.1軟件進(jìn)行翻譯獲得氨基酸序列。所測(cè)基因序列和其推測(cè)的氨基酸序列分別與Gen－Bank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn和BLASTp同源性比對(duì)。采用軟件DNA Man v 4.1中Neighbor－joining法構(gòu)建所測(cè)基因序列和其推測(cè)的氨基酸序列與高同源性序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 假定可變表面蛋白成熟肽表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)克隆到的假定可變表面蛋白編碼基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增和克隆其成熟肽基因序列。設(shè)計(jì)引物如下：Primer1：5′－CCCGAATTCGCAGTAATTGCTTGTGGTG－3′（下劃線處是EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）；Primer2：5′－CCGCTCGAGAAGGGCTTATCTGG－AACAT－3′（下劃線處是 XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)采用50μL體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物純化回收后經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，酶切產(chǎn)品連接到pET－32a（＋）載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，菌液PCR鑒定，選取陽性克隆測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）。

1.2.4 假定可變表面蛋白成熟肽的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS－PAGE與 Western blot分析

1.2.4.1 假定可變表面蛋白成熟肽的誘導(dǎo)表達(dá)重組E.coli BL21（DE3）接種到含有100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200r／min、37℃ 培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD 600nm值達(dá)到0.6時(shí)加入終濃度為分別為0.05、0.1、0.3、0.5、0.7mmol／L IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.2.4.2 超聲破碎 重組E.coli BL21（DE3）經(jīng)0.5mmol／L IPTG誘導(dǎo)5h后，5 000r／min離心收集菌體。菌體用無菌蒸餾水重懸，在－20℃反復(fù)凍融3次，冰浴超聲破壁，功率300W，持續(xù)4s后停止4s，反復(fù)50個(gè)循環(huán)。超聲破壁后菌體12 000 r／min離心10min，分別收集離心上清液和沉淀。

1.2.4.3 SDS－PAGE蛋白分析 將1mL經(jīng)0.5 mmol／L IPTG誘導(dǎo)1、2、3、4、5h后的菌液12 000 r／min離心1min后，向沉淀中加入50μL無菌水和50μL 2×蛋白上樣緩沖液，煮沸5min。各取50 μL重組菌體超聲破碎上清液和沉淀的重懸液，與50μL 2×蛋白上樣緩沖液混合，煮沸5min。取上述上樣樣品各15μL進(jìn)行120mL／L的SDS－PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，ddH2O脫色。

1.2.4.4 Western blot分析 蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)后用His鎳柱純化目的蛋白。取純化后的蛋白20μL上樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至NC膜上，用含50g／L脫脂奶粉的封閉液室溫封閉3h，換含20g／L脫脂奶粉的封閉液，加入兔抗 Mmc PG3標(biāo)準(zhǔn)株高免血清，37℃搖床反應(yīng)1h。1×TBST洗滌5次，每次5min。于1×TBST中加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃搖床反應(yīng)1h，用ECL顯色3min后，ddH2O終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白編碼基因的擴(kuò)增與克隆

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10g／L瓊脂糖凝膠上電泳，在約574bp處顯示明顯的條帶（圖1）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI ORF Finder分析得到序列長(zhǎng)度為417bp的ORF。將此ORF序列提交Gen－Bank，得到注冊(cè)號(hào)KC170277。

圖1 Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白編碼基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of putative variable surface lipoprotein gene of Mmc str.PG3

2.2 假定可變表面脂蛋白基因的序列分析

將Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因序列（GenBank注冊(cè)號(hào)KC170277）和預(yù)測(cè)的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的已知序列進(jìn)行BLAST分析。比對(duì)結(jié)果顯示這個(gè)預(yù)測(cè)氨基酸序列與Mm Cluster中除了Mccp外的所有成員的可變表面脂蛋白氨基酸序列具有親緣關(guān)系。Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列與Mmc str.GM12的可變脂蛋白基因序列MMCAP2－0900（GenBank注冊(cè)號(hào)：CP001668）和其預(yù)測(cè)氨基酸序列（GenBank注冊(cè)號(hào)：ACU78364）相似性最高，為95% 和91%。

用 DNA Man v 4.1中 Neighbor－joining法對(duì)Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2和圖3）。由圖2可見，Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因與MmmSC str.Gladysdale的保守假定蛋白的基因MMS－A1125（GenBank注冊(cè)號(hào)：NC－015431）在系統(tǒng)進(jìn)化樹上構(gòu)成一個(gè)進(jìn)化分支。這個(gè)分支和Mmc str.95010的2個(gè)可變脂蛋白基因 MLC－9030、MLC－9070（GenBank注冊(cè)號(hào)：NC－015431）距離較近，形成一個(gè)大的進(jìn)化分支。圖3顯示，絲狀支原體山羊亞種PG3可變表面脂蛋白基因的預(yù)測(cè)氨基酸序列與Mmc str.GM12的可變脂蛋白（GenBank注冊(cè)號(hào)：ACU78364）構(gòu)成一個(gè)進(jìn)化分枝。這個(gè)分枝和MmmSC str.Gladysdale的保守假定蛋白（GenBank注冊(cè)號(hào)：ADK69040）距離較近。它們構(gòu)成的進(jìn)化分枝與Mmc str.95010的兩個(gè)可變脂蛋白（GenBank注冊(cè)號(hào)：YP－004400610，YP－004400614）和 Mmc str.GM12的可變脂蛋白（GenBank注冊(cè)號(hào)：ACU78934）形成一個(gè)大的進(jìn)化分枝。

圖2 Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因與其同源基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic relationship between putative variable surface lipoprotein gene of Mmc str.PG3with homologous genes in GenBank

2.3 假定可變表面脂蛋白基因的預(yù)測(cè)氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征

Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因用DNAStar v 7.1軟件進(jìn)行翻譯，預(yù)測(cè)到由138個(gè)氨基酸組成的前脂蛋白，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)與Mm Cluster中已報(bào)道的其他可變表面脂蛋白的氨基酸序列結(jié)構(gòu)高度相似［6－7，10］。此前脂蛋白的氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征見圖4，多肽鏈第20個(gè)到第24個(gè)氨基酸，即AVIAC，極為可能是前脂蛋白的信號(hào)肽酶Ⅱ的識(shí)別序列［12］。此前脂蛋白若經(jīng)酶切裂解后，形成一個(gè)由23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和一個(gè)由115個(gè)氨基酸組成的成熟肽。多肽鏈第34個(gè)到第37個(gè)氨基酸、第51個(gè)到第54個(gè)氨基酸是兩個(gè)短重復(fù)序列，即KEEK，MmmSC str.PG1的Vmm多肽鏈的羧基端也同樣存在兩個(gè)由4個(gè)氨基酸KAPD組成的短重復(fù)序列［6］。BLASTp比對(duì)結(jié)果顯示此前脂蛋白的信號(hào)肽與Mmc str.95010和GM12可變表面脂蛋白家族成員的信號(hào)肽的序列相似性為96%～91%，與MmmSC str.PG1的Vmm的信號(hào)肽的序列相似性為87%，與Mcc str.California kid的Vmc可變表面脂蛋白家族成員的信號(hào)肽的序列相似性為82%～63%，與 Ml str.PG50和 Ml str.99／014／6的Vlc可變表面脂蛋白家族成員的序列相似性為96%～74%。而前脂蛋白的成熟肽除了與Mmc str.GM12的 VlcF（MMCAP2－0900）和 Mmc str.95010的兩個(gè)可變表面脂蛋白（MLC－9030、MLC－9070）的成熟肽區(qū)域序列相似性較高外（分別為91%、81%和77%），與其他的可變表面脂蛋白序列相似性均低于50%。由此可見，這個(gè)預(yù)測(cè)的前脂蛋白的信號(hào)肽序列保守，成熟肽序列變異較大。

圖3 Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因的預(yù)測(cè)氨基酸與其同源氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic relationships of putative variable surface lipoprotein aminoacids of Mmc str.PG3with homologous aminoacids in GenBank

圖4 Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因的預(yù)測(cè)氨基酸序列結(jié)構(gòu)Fig.4 Schematic illustrations of the putative variable surface lipoprotein precursor of Mmc str.PG3

雖然Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因的預(yù)測(cè)氨基酸序列與Mmc str.GM12的可變表面脂蛋白（GenBank注冊(cè)號(hào)ACU78364）的氨基酸序列相似性最高，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與其遺傳進(jìn)化距離最近，但是多肽鏈氨基酸組成數(shù)目卻比Mmc str.GM12的可變表面脂蛋白的少72個(gè)，差異較大。運(yùn)用生物學(xué)軟件DNAMAN v 4.1對(duì)二者的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見圖5。Mmc str.GM12的可變表面脂蛋白（GenBank注冊(cè)號(hào)ACU78364）多肽鏈的羧基端具有兩個(gè)由24個(gè)氨基酸組成的相鄰不連續(xù)的長(zhǎng)重復(fù)序列，兩個(gè)重復(fù)序列相隔43個(gè)氨基酸。在Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白多肽鏈的相應(yīng)位置缺失了間隔序列和其下游的重復(fù)序列。由此推斷，Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因可能是Mmc str.GM12的可變表面脂蛋 白 基 因 MMCAP2－0900（GenBank注 冊(cè) 號(hào)CP001668）內(nèi)兩個(gè)重復(fù)序列的間隔序列以及其下游重復(fù)序列的缺失導(dǎo)致的突變產(chǎn)物。假定可變表面脂蛋白基因內(nèi)由于重復(fù)序列的缺失而導(dǎo)致了二者分子大小及相變異，這一現(xiàn)象與豬鼻支原體變異表膜脂蛋白Vlp的相變異類似，豬鼻支原體變異表膜脂蛋白基因vlps通過其變異區(qū)重復(fù)序列的缺失和插入產(chǎn)生基因的重排和移碼突變來控制基因表達(dá)的開與關(guān)，從而導(dǎo)致抗原的相變異，這種變異使得支原體能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，有利于其在宿主體內(nèi)的長(zhǎng)期生存［13］。

圖5 Mmc str.PG3假定可變表面脂蛋白基因的預(yù)測(cè)氨基酸序列與Mmc str.GM12的假定可變表面脂蛋白的氨基酸序列（AUC78364）比對(duì)結(jié)果Fig.5 Alignment of predicted amino acid sequence of putative variable surface lipoprotein gene of Mmc str.PG3and that of Mmc str.GM12（AUC78364）

2.4 假定可變表面脂蛋白成熟肽在E.coli BL21（DE3）中的表達(dá)分析

對(duì) 重 組 質(zhì) 粒 pET－32a （＋ ）－putative variable surface lipoprotein轉(zhuǎn)化入E.coliBL21（DE3）后的菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)（圖6），在SDS－PAGE凝膠上和NC膜上出現(xiàn)大小約為31ku的條帶，與預(yù)測(cè)的目產(chǎn)物大小一致。加入0.5mmol／L IPTG 4h后假定可變表面脂蛋白成熟肽在E.coliBL21（DE3）中的的表達(dá)量達(dá)到最大，所以在37℃ 條件下最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mmol／L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4h。重組菌體超聲破碎上清液中在相對(duì)分子質(zhì)量約為31 ku處觀察到目的條帶，而在沉淀中沒有出現(xiàn)或出現(xiàn)比較弱的條帶，表明目的蛋白成功表達(dá)并以可溶形式存在。

圖6 SDS－PAGE電泳檢測(cè) BL21（DE3）／pET－32a（＋）－putative variable surface lipoprotein誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot結(jié)果Fig.6 SDS－PAGE and Western blot results of cell lysate derived fromE.coli BL21（DE3）transformed with pET－32a（＋）－putative variable surface lipoprotein

3 討論

Mmc感染導(dǎo)致患病羊產(chǎn)生全身多系統(tǒng)綜合癥，包括胸膜肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、結(jié)膜炎和敗血癥等，有時(shí)也可見中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和流產(chǎn)。該病廣泛流行于中亞、北非和中東等山羊養(yǎng)殖集中的國(guó)家和地區(qū)，在我國(guó)主要發(fā)生于貴州和廣西地區(qū)。Mmc的感染引起的傳染性胸膜肺炎和漸進(jìn)性消瘦導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅山羊養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。目前還不清楚Mmc的致病機(jī)制，但是研究者們普遍認(rèn)為可變表面脂蛋白與Mmc刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)以及產(chǎn)生致病力有密切關(guān)系［14－15］。

本研究克隆到了Mmc str.PG3的一個(gè)假定可變脂蛋白基因，通過生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)它與 Mmc str.95010的基因 MLC－9030和Mmc str.GM12的基因MMCAP2－0900親緣關(guān)系最近。它們的預(yù)測(cè)氨基酸序列結(jié)構(gòu)一致性較高，均具有與Mm Cluster中已報(bào)道的可變表面脂蛋白的氨基酸序列相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。據(jù)此推測(cè)Mmc str.PG3的假定可變脂蛋白基因與 Mmc str.95010的可變脂蛋白基因簇（MLC－9030～MLC－9050，MLC－9070～MLC－9090）和 Mmc str.GM12的可變脂蛋白基因簇（MMCAP2－0900～MMCAP2－0904）都是支原體可變表面脂蛋白基因家族成員。

在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，此假定可變脂蛋白基因和預(yù)測(cè)氨基酸序列與MmmSC str.Gladysdale的保守假定蛋白的基因MMS－A1125和預(yù)測(cè)氨基酸序列都聚成一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系比假定可變脂蛋白基因與 Mmc str.95010的基因 MLC－9030和 Mmc str.GM12的基因 MMCAP2－0900的親緣關(guān)系還近。并且，假定可變脂蛋白基因與其核苷酸和氨基酸序列的相似性均較高，分別為92% 和85%。但是MmmSC str.Gladysdale的保守假定蛋白多肽鏈的結(jié)構(gòu)與假定可變脂蛋白以及Mm cluster中已報(bào)道的可變表面脂蛋白多肽鏈的結(jié)構(gòu)差異較大。MmmSC str.Gladysdale的保守假定蛋白多肽鏈沒有保守的信號(hào)肽和跨膜區(qū)，它只與Mm cluster中可變表面脂蛋白多肽鏈羧基端部分區(qū)域高度保守。所以，可以認(rèn)定MmmSC str.Gladysdale的保守假定蛋白不屬于可變表面脂蛋白家族。MmmSC str.Gladysdale的保守假定蛋白的功能還不清楚，但是它與Mm cluster中可變表面脂蛋白多肽鏈羧基端部分區(qū)域的高度保守性預(yù)示著該蛋白與可變表面脂蛋白可能具有某些相似的生物學(xué)功能。

同時(shí)，本研究構(gòu)建了編碼此假定可變脂蛋白成熟肽基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，并在E.coli BL21（DE3）細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究支原體可變表面脂蛋白的功能和絲狀支原體山羊亞種的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 儲(chǔ)岳峰.我國(guó)山羊（接觸）傳染性胸膜肺炎病原學(xué)、流行病學(xué)研究及滅活疫苗的研制［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，2011.

［2］ 吳移謀，葉元康.支原體學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：70－71.

［3］ Le Grand D，Solsona M，Rosengarten R，et al.Adaptive surface antigen variation in Mycoplasma bovis to the host immune response［J］.FEMS Microbiol Lett，1996，144（2－3）：267－275.

［4］ Zhang Q，Wise K S.Localized reversible frameshift mutation in an adhesin gene confers a phase－variable adherence phenotype in mycoplasma［J］.Mol Microbiol，1997，25（5）：859－869.

［5］ Washburn L R，Weaver K E，Weaver E J，et al.Molecular characterization of Mycoplasma arthritidis variable surface protein MAA2［J］.Infect Immun，1998，66（6）：2576－2586.

［6］ Persson A，Jacobsson K，F(xiàn)rykberg L，et al.Variable surface protein vmm of Mycoplasma mycoides subsp.mycoides small colony type［J］.J Bacteriol，2002，184（13）：3712－3722.

［7］ Wise K S，F(xiàn)oecking M F.Distinctive repertoire of contingency genes conferring mutation－based phase variation and combinatorial expression of surface lipoproteins in Mycoplasma capricolumsubsp.capricolumof the Mycoplasma mycoides phylogenetic cluster［J］.J Bacteriol，2006，188（13）：4926－4941.

［8］ Hamsten C，Westberg J，B?lske G，et al.Expression and immunogenicity of six putative variable surface proteins in Mycoplasma mycoides subsp.mycoides SC［J］.Microbiology，2008，154：539－549.

［9］ Wise K S，Calcutt M J，F(xiàn)oecking M F，et al.Complete genome sequences of Mycoplasma leachii strain PG50Tand pathogenic Mycoplasma mycoides subsp.mycoides small colony biotype strain gladysdale［J］.J Bacteriol，2012，194（16）：4488－4449.

［10］ Thiaucourt F，Manso－Silvan L，Salah W，et al.Mycoplasma mycoides，from “mycoides small colony”to“capri”.A microevolutionary perspective［J］.BMC Genomics，2011，12：114.

［11］ 郝瑞霞.綿羊肺炎支原體的分離鑒定及全基因組序列的測(cè)定和分析［D］.內(nèi)蒙古呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，2012.

［12］ Braun V，Wu H C.Lipoproteins，structure，function，biosynthesis and model for protein export［J］.New Compr Biochem，1994，27：319－341.

［13］ Yogev D，Watson－McKown R，Rosengarten R，et al.Increased structural and combinatorial diversity in an extended family of genes encoding Vlp surface proteins of Mycoplasma hyorhinis［J］.J Bacteriol，1995，177（19）：5636－5643.

［14］ Chopra－Dewasthaly R，Baumgartner M，Gamper E，et al.Role of Vpma phase variation in Mycoplasma agalactiae pathogenesis［J］.FEMS Immunol Med Mic，2012，66（3）：307－322.

［15］ Browning G F，Marenda M S，Noormohammadi A H，et al.The central role of lipoproteins in the pathogenesis of mycoplasmoses［J］.Vet Microbiol，2011，153（1－2）：44－50.