短小乳桿菌重組S-層蛋白質的純化及其體外黏附性的初步鑒定

王彩鳳，敖敦格日勒，小 琴，特尼格爾，趙 慧，格日勒圖

（內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特010018）

S-層蛋白質（S-layer protein，SLP）是指由一層晶格狀排列的單分子蛋白或糖蛋白亞單位組成的胞漿外層結構［1］。它是位于某些革蘭陽性細菌和革蘭陰性細菌以及古細菌的細胞表面獨特結構，其厚度通常約為5nm～15nm，分子質量約為40ku～200ku，而乳酸桿菌的S-層蛋白質分子質量相對較小，約為25ku～71ku［2］。與其他細菌的SLP 相比，乳酸菌SLP的顯著特點是分子量小、等電點高。幾乎所有SLP均可自組裝成二維的傾斜的、正方形的、六邊形的對稱晶格結構，覆蓋在整個菌體表面，以非共價鍵相互作用。

研究表明，無論是在溶液中還是多種固相載體上，SLP 可以在熵的驅動下自組裝成晶格結構［3］。這一特點使其在納米技術、納米生物技術領域備受研究者青睞。如借助基因工程技術，將SLP 的基因克隆至合適的表達載體中，獲得的重組SLP 的結構和性質并未發(fā)生變化［4］。甚至經(jīng)過遺傳改造，原本不具有黏附能力的乳酸菌，通過表達了SLP 以后可獲得黏附能力［5］。在醫(yī)學領域，乳酸桿菌SLP因其高度規(guī)則的結構，顯著的黏附能力和自組裝能力，可望發(fā)展為潛在的免疫治療和預防的候選材料，如藥物靶標、疫苗和活性抗原遞呈載體［6］。此外，SLP可作為毒力因子在確定和維持細胞的形狀上起作用［7］，也可作為細胞黏附的介質物，也可作為未成熟樹突狀細胞和T 細胞的調節(jié)器［8］，還可作為保護層，分子篩，胞壁質水解酶等發(fā)揮作用［9］。而乳酸菌的SLP在異源蛋白質的分泌性表達甚至表面展示等方面有著更廣闊的應用前景。

本研究應用基因工程技術克隆短小乳桿菌（Lactobacillus brevis）內蒙古分離株的slp基因，獲得其大腸埃希菌表達產(chǎn)物并進行鑒定，最后對純化的重組SLP的黏附特性進行初步鑒定和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒E.coliDH5α、E.coliBL21（內蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學與醫(yī)學學院實驗研究中心分離并保存）；乳酸乳球菌NZ9000（購自荷蘭）；載體pGEX-4T-3（Invitrgen）；重組質粒pMD19T-slp（內蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學與醫(yī)學學院實驗研究中心構建）。

1.1.2 主要試劑 普通質粒小提取試劑盒（TIANGEN），BCA 蛋白定量試劑盒（康為世紀公司），XhoⅠ、BamHⅠ、TaqDNA 聚合酶、T4DNA 連接酶、膠回收試劑盒（TaKaRa），鼠抗GST 血清（日本帶廣畜產(chǎn)大學原蟲病研究中心制備），山羊抗鼠IgGHRP（Invitrogen），透析袋（上海西諾公司），96孔酶標板（康公司寧）；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設計 應用Primer Premier v5.0生物軟件設計以下一對引物：

P1：5′-GACGGATCCATCGTGAGCGCTGCTG-3′（劃線部分為BamHⅠ酶切位點）

P2：5′-GCTCTCGAGCTAGAGATTGTAAACG-3′（劃線部分為XhoⅠ酶切位點）。引物由上海桑尼生物科技公司合成。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體pGEX-slp 的構建及鑒定以重組質粒pMD19T-slp為模板，應用PCR 方法擴增出的片段，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切得到slp目的片段，插入到相同酶處理的原核表達載體pGEX-4T-3中，成功構建原核表達載體pGEX-slp并進行鑒定。

1.2.2 slp基因IPTG 誘導表達條件的優(yōu)化 首先將重組質粒pGEX-slp和質粒pGEX-4T-3（空載體）轉化至E.coliBL21感受態(tài)細胞中，在Amp抗性的LB平板上挑取陽性菌落，轉接到3 mL LB 培養(yǎng)基中于37 ℃過夜培養(yǎng)，次日將此培養(yǎng)物按1∶100比例轉接于20mL LB中，于37 ℃、200r／min搖菌培養(yǎng)至OD600nm 值為0.5～0.7 時，加入適量的IPTG（終濃度為1mmol／L）進行誘導表達5h。并按0h（加入IPTG 之前）、0.5、1、2、3、4、5h 各取1mL菌液留樣，離心收集菌體，加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液制備樣品，進行SDS-PAGE 分析。以同樣的方法，將過夜培養(yǎng)物按1∶100 比例轉接于5mL LB中，于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm 值為0.5～0.7 時，加入不同終濃度的IPTG（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mmol／L）進行誘導表達5h。以同樣的方法制備樣品，進行SDS-PAGE分析。

1.2.3 Western blot鑒定重組融合蛋白GST-SLP根據(jù)1.2.2試驗確定的最佳IPTG 誘導表達條件進行誘導，制備樣品，首先進行SDS-PAGE 分析，然后按常規(guī)方法將凝膠轉移到硝酸纖維素膜上。其中第一抗體為鼠抗GST 血清，第二抗體為山羊抗鼠IgG-HRP，底物為DAB。常規(guī)方法進行顯色觀察結果并記錄。

1.2.4 純化和鑒定重組融合蛋白GST-SLP 根據(jù)1.2.2試驗確定的最佳誘導表達條件，將重組菌種轉接于1 000mL LB中，于37 ℃200r／min培養(yǎng)至OD600nm 值 為0.5～0.7 時，加入終濃度為3.0mmol／L IPTG 誘導5h。離心收集菌體沉淀，用PBS（50mmol／L，pH 7.0）重新懸浮沉淀，超聲裂解菌體，離心棄上清，沉淀懸浮于5 mol／L LiCl溶液，于4℃靜置18h。離心取上清，于4℃將上清液在PBS 中透析18h，將透析液用蛋白質濃縮儀濃縮，用SDS-PAGE 檢測純化情況。并用BCA 試劑盒檢測重組融合蛋白GST-SLP的濃度。

1.2.5 體外鑒定重組融合蛋白GST-SLP的黏附特性 30 ℃靜置培養(yǎng)乳酸乳球菌NZ9000至第3代，將培養(yǎng)物離心棄上清，沉淀用PBS 洗2 遍，濁度調至OD600nm＝1.0。每個樣品3個重復，將該菌液加入96孔酶標板中4 ℃過夜包被，次日用30g／L脫脂乳封閉1.5h。加入純化的重組融合蛋白GSTSLP，取4個濃度梯度（110.0、55.0、36.7、27.5μg／mL），常溫結合1.5h。加入一抗溶液（鼠抗GST 血清，用30g／L脫脂乳按1∶1 000稀釋），常溫結合1.5h。加入二抗溶液（山羊抗鼠IgGHRP，用30g／L脫脂乳按1∶4 000稀釋），常溫結合1.5h。加入底物TMB 顯色，振蕩15s，室溫靜置15min，測OD652mm 值，再加終止液，測OD450mm值。本試驗共設計3個對照組，分別去除了重組融合蛋白GST-SLP 與脫脂乳以及抗體與NZ9000表面、脫脂乳的非特異性結合的影響，最后算出4個濃度梯度下重組融合蛋白GST-SLP 與NZ9000表面特異性結合的凈值，即4 個濃度梯度的樣品組在450nm 處的凈吸光值，以此作一柱圖，并進行誤差分析。

2 結果

2.1 重組表達質粒pGEX-slp的酶切鑒定

重組表達質粒pGEX-slp經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，得到約1 200bp的目的基因片段和約5 500bp的載體片段（圖1），與PCR 方法擴增出的1 200bp特異性條帶大小相符（圖2）。

圖1 重組質粒pGEX-slp的酶切鑒定Fig.1 Identification of the plasmid pGEX-slp by enzyme digestion

2.2 重組表達載體pGEX-slp最佳IPTG誘導表達條件的確定

圖2 slp基因PCR 產(chǎn)物Fig.2 PCR products of slp gene

經(jīng)SDS-PAGE 方法檢測，結果表明，成功表達了重組GST 蛋白和重組融合蛋白GST-SLP，其大小分別約為27ku 和71ku，與預計理論值大小相符。IPTG 誘導表達的最佳時間條件和最佳濃度條件分別為5h（圖3）和3.0mmol／L（圖4）。

圖3 不同時間IPTG 誘導表達的結果Fig.3 Expression results of different time induced by IPTG

圖4 不同濃度IPTG 誘導表達的結果Fig.4 Expression results of different IPTG concentrations

2.3 重組融合蛋白GST-SLP的Western blot檢測結果

經(jīng)Western blot檢測，重組融合蛋白GST-SLP能被鼠抗GST 血清所識別，分別約在約71ku 和27ku處有特異性反應條帶；而對照組重組GST 蛋白則在約27ku處同樣出現(xiàn)了特異性的條帶，該結果與實際情況相符合（圖5）

2.4 重組融合蛋白GST-SLP的純化結果

采用最佳的濃度和時間誘導條件進行大量誘導后，收集菌體沉淀，經(jīng)超聲波破碎、5mol／L LiCl溶液處理、透析、濃縮，得到純化的蛋白樣品，結果如圖6所示，SDS-PAGE顯示71ku處有一條優(yōu)勢條帶，其濃度約為1.1mg／mL。

2.5 重組融合蛋白GST-SLP的ELISA 鑒定結果

根據(jù)4個濃度梯度的樣品組在450nm 處的凈吸光值作一柱圖，分析重組融合蛋白GST-SLP 與NZ9000表面的黏附特性強弱，試驗結果如圖7 所示，顯示呈陽性，可初步證明當重組融合蛋白GSTSLP濃度為110.0μg／mL 時，與NZ9000表面有較強的黏附特性；但是當濃度低時，它與NZ9000表面的黏附特性則較弱。

圖5 表達產(chǎn)物的Western blot鑒定Fig.5 Analysis of the expressed products by Western blot

圖6 純化的重組融合蛋白GST-SLP的電泳分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified recombinant fusion protein GST-SLP

圖7 重組融合蛋白GST-SLP的ELISA 分析Fig.7 ELISA analysis of recombinant fusion protein GST-SLP

3 討論

細菌表面SLP 是體內和體外納米生物技術應用方面的最優(yōu)秀的候選蛋白，因為它具有自組裝成二維晶格的能力，這種晶格形成了某些細菌表面的最外層結構［2，6，10］。乳酸桿菌作為人和動物消化道中重要的正常微生物，國外學者利用SLP的特性已在乳酸桿菌細胞表面成功展示了一些生物活性蛋白質或多肽，即通過基因工程方法使外源蛋白表達并展示到細菌的細胞外膜上［2］。據(jù)報道，乳酸桿菌對小腸的黏附作用與SLP 有 關［2，11-12］。Khang Y H等［6］利用短小乳桿菌SLP 黏附于腸上皮細胞的特性，成功利用短小乳桿菌重組SLP來介導抗體黏附于小牛腸細胞從而有效地預防了新生牛腹瀉綜合癥。

本試驗成功克隆了短小乳桿菌SLP 基因slp，原核表達并鑒定表達產(chǎn)物，最后對純化的重組SLP的黏附特性進行了初步鑒定。應用PCR 方法正確擴增slp基因獲得約1 200bp的片段，這與相關報道［13］的結果一致。用IPTG 誘導表達重組表達載體pGEX-slp，發(fā)現(xiàn)影響表達的主要因素包括：細菌生長期、細胞生長速率和IPTG 誘導濃度。因為細胞生長速率對外源蛋白的表達也有影響，所以誘導時機和誘導物的用量必須嚴格控制。而在生長不足或過度都會使外源蛋白降低表達量，甚至不表達。IPTG 的濃度適宜對表達外源基因十分重要，本試驗已確定的IPTG 誘導表達的最佳溫度為37 ℃，最佳IPTG 濃度為3.0mmol／L，最佳誘導時間為5h。

S-層蛋白以非共價鍵與宿主表面結合。為了研究乳酸菌S-層蛋白的一些性質，有時需要將其從細胞表面提取出來。常用的提取方法是高濃度變性劑處理的方法，如尿素、鹽酸胍、氯化鋰、金屬螯合劑及陽離子置換劑等［14］。本試驗采用的高濃度變性劑是氯化鋰。由于S-層蛋白具有自我組裝特性，因此提取的S-層蛋白液體透析去除變性劑后，又可以自動聚集為有活性的S-層蛋白。提取的S-層蛋白應用SDS-PAGE 方法進行了檢測，結果顯示在71ku處有一優(yōu)勢條帶，證明本試驗已獲得了較高純度的重組融合蛋白GST-SLP，這是進行其體外黏附特性的鑒定試驗的前提條件。

重組SLP的體外黏附特性鑒定試驗結果顯示該蛋白質在高濃度時與NZ9000 表面黏附效果較強，而低濃度時黏附效果則較弱，這種濃度依賴性是與重組蛋白質純化方法有關或是S-層蛋白其本身活性的改變導致或是融合外源性蛋白質的原因，尚需要進一步試驗研究來證實。

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