SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨分化實(shí)驗(yàn)研究

曾鐵功，趙晉英，黃澤智

(邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，邵陽(yáng)市分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南邵陽(yáng)422000)

傷殘肢體的完美修復(fù)，一直是人類(lèi)的夢(mèng)想，以干細(xì)胞工程為代表的現(xiàn)代組織工程學(xué)無(wú)疑為人類(lèi)提供了新的期望［1］。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是存在于骨髓中的一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，在體內(nèi)外適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等多種組織。BMSCs移植具有簡(jiǎn)單、實(shí)用、費(fèi)用低和無(wú)免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)，成為目前解決大塊骨缺損修復(fù)最有前景的手段之一［2］。2012年1～8月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，旨在探討B(tài)MSCs這類(lèi)種子細(xì)胞成骨分化的條件，為后期骨組織修復(fù)工程研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡清潔級(jí)SD大鼠8只，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．1．2 主要試劑 DMEM-LG培養(yǎng)基(美國(guó) Gibco公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物公司)，胰酶(北京鼎國(guó)生物公司)，BCIP/NBT堿性磷酸酶(ALP)染色試劑和MTT試劑(北京鼎國(guó)生物公司)，茜素紅(天津大茂化學(xué)試劑廠)。

1．2 方法

1．2．1 BMSCs的分離及體外培養(yǎng) 運(yùn)用全骨髓貼壁法。清潔級(jí)4周齡SD大鼠，脫頸處死;75%乙醇浸泡10 min，剝離雙股骨表面組織;無(wú)菌DMEM沖洗，剪斷骨兩端后，大號(hào)注射器吸取DMEM液(10%FBS，100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和20 U/mL肝素)沖洗髓腔;收集骨髓于一離心管，反復(fù)吹打，180 g×5 min離心;下層細(xì)胞層經(jīng)DMEM液混勻后接種于25 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。48 h首次換液，以后3 d換液1次。待細(xì)胞密度達(dá)80%，棄培養(yǎng)液;用PBS輕沖3遍，加入2．5 g/L胰蛋白酶消化、傳代。傳代時(shí)細(xì)胞接種密度1×104/cm2，收集第3代細(xì)胞備用，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。

1．2．2 成骨誘導(dǎo)液配制 在DMEM培養(yǎng)液中加入地塞米松(Dex)1×10-7mol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L和Vit-C 1×10-6mol/L，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

1．2．3 細(xì)胞生長(zhǎng)觀察 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，鏡檢拍照。

1．2．4 細(xì)胞爬片ALP染色 在6孔板上每孔滴少量培養(yǎng)基，無(wú)菌操作每孔放入1張預(yù)處理的蓋玻片;按1×104/cm2接種第3代BMSCs，補(bǔ)足含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液2．5 mL/孔;待貼壁2 d后，實(shí)驗(yàn)組換成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后3 d換液1次。分別在第3、6、10天，取出玻片經(jīng)預(yù)冷 PBS洗2遍，冷4%多聚甲醛固定20 min;PBS沖洗后，用BCIP/NBT試劑37℃染色30 min;水洗，脫水透明，中性樹(shù)膠封片后鏡檢。藍(lán)色顆粒為陽(yáng)性染色，鏡檢拍照。對(duì)照組不加誘導(dǎo)液，細(xì)胞爬片染色同實(shí)驗(yàn)組。

1．2．5 MTT比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 哺乳動(dòng)物活細(xì)胞與噻唑藍(lán)作用后產(chǎn)生紫色結(jié)晶，用二甲基亞砜溶解結(jié)晶后，在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定該溶液光吸收值，可間接反映活細(xì)胞增殖能力。以1×104/cm2接種細(xì)胞于96孔板，實(shí)驗(yàn)組每孔加入200μL誘導(dǎo)液，對(duì)照組加等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液。置5%CO2孵箱中培養(yǎng)，3 d換液1次。每天取1板，用MTT法測(cè)每孔吸光度值，共8 d。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度均值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1．2．6 成骨鈣化茜素紅染色 6孔板上實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組連續(xù)培養(yǎng)13 d后，細(xì)胞爬片行茜素紅染色。4%多聚甲醛固定30 min，水洗;茜素紅染色30 min，脫水透明，封片后鏡檢。礦化結(jié)節(jié)被染成深紅色。

1．2．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)用±s表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、形態(tài)變化 培養(yǎng)的大鼠原代BMSCs 24～36 h開(kāi)始貼壁，48～72 h貼壁細(xì)胞呈短梭形;4～5 d時(shí)細(xì)胞集落明顯，細(xì)胞主要為短梭形成纖維樣細(xì)胞，部分為多邊形上皮樣細(xì)胞，另外混雜圓形的非貼壁細(xì)胞，經(jīng)換液逐漸清除。原代細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，10 d后細(xì)胞匯合達(dá)80%以上。傳代細(xì)胞4～6 h迅速貼壁、伸展，恢復(fù)梭形，10 h左右細(xì)胞呈均勻生長(zhǎng)，形態(tài)較為一致，以細(xì)長(zhǎng)梭形為主。5～6 d后融合為單層，長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底，培養(yǎng)過(guò)程中未見(jiàn)明顯白色結(jié)節(jié)形成。實(shí)驗(yàn)組在成骨誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中向梭性、多角形轉(zhuǎn)化，有的帶有數(shù)個(gè)突起，排列漸變不規(guī)則。細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸密集融合成團(tuán)，10 d左右呈復(fù)層生長(zhǎng)，形成多層細(xì)胞;以后逐漸形成多個(gè)散在的島狀致密細(xì)胞群，呈旋渦狀，中間細(xì)胞排列緊密模糊，逐漸形成白色鈣化結(jié)節(jié)。插頁(yè)Ⅱ圖4。

2．2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 對(duì)照組BMSCs傳代接種第1天后細(xì)胞數(shù)量即開(kāi)始增加，第4天增加幅度最大，至第7天細(xì)胞數(shù)量最大，以后數(shù)量略有下降，未出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期。傳代培養(yǎng)對(duì)數(shù)增殖期為2～6 d，第7天細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)成骨誘導(dǎo)的BMSCs增殖速度明顯落后于前者，也未出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2．3 細(xì)胞爬片ALP染色 對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞較少，呈稀疏條索狀;而實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增多，鏡下見(jiàn)大部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有藍(lán)色顆粒狀或片狀沉淀，見(jiàn)封三圖5。第10天，隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)算結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組ALP染色陽(yáng)性率為88．34% ±8．65%，而對(duì)照組為28．14% ±5．38%，P ＜0．01。

2．4 成骨鈣化茜素紅染色情況 實(shí)驗(yàn)組第13天可見(jiàn)橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，為茜素紅與鈣鹽形成的橘紅色復(fù)合物。對(duì)照組幾乎無(wú)色。見(jiàn)封三圖6。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠BMSCs分離純化、體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的研究，為BMSCs作為骨組織工程的種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。目前分離純化BMSCs的方法主要有4種，即全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀和免疫磁珠法［3，4］。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法，該法操作簡(jiǎn)便，僅通過(guò)換液和傳代篩選，便可獲得較多BMSCs，且早期保留了骨髓中的其他成分，可為BMSCs的生長(zhǎng)創(chuàng)造了良好的環(huán)境。在本實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)的原代細(xì)胞8～10 d便可貼壁生長(zhǎng)連接成片，形態(tài)主要為短梭形成纖維樣細(xì)胞。原代細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，傳代細(xì)胞生長(zhǎng)快，細(xì)胞形態(tài)較為一致。傳代5～6 d后可融合為單層，長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底。BMSCs原代和傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特性，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［5，6］。

部分體外培養(yǎng)的BMSCs能自發(fā)分化為成骨細(xì)胞，但大部分不表達(dá)或低表達(dá)ALP，分泌的鈣含量也很低，要想其穩(wěn)定地向成骨分化，需加以誘導(dǎo)［7］。本實(shí)驗(yàn)參考Coelho等的方法，通過(guò)加入Dex、β-甘油磷酸鈉、Vit-C對(duì)BMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)［8］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)BMSCs增殖較快;經(jīng)誘導(dǎo)后增殖速度顯著下降，細(xì)胞匯合時(shí)間明顯延長(zhǎng)，進(jìn)一步證明了適當(dāng)濃度的Dex抑制BMSCs的增殖［9］。這也提示要想獲得分化細(xì)胞的穩(wěn)定增長(zhǎng)，接種細(xì)胞的基數(shù)要有保證。本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)后細(xì)胞大多向梭性、多角形轉(zhuǎn)化，排列漸變不規(guī)則，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸密集;10 d左右呈復(fù)層生長(zhǎng)，以后逐漸形成多個(gè)散在的島狀致密細(xì)胞群，中間細(xì)胞排列緊密模糊，形成白色鈣化結(jié)節(jié)。其原因可能為誘導(dǎo)液中Dex促進(jìn)胞外膠原合成［10］;β-甘油磷酸鈉可為BMSCs分化和增殖提供磷原子，促進(jìn)生理性鈣鹽沉積;Vit-C也促進(jìn)膠原合成，增加鈣鹽沉積等［11］。但本實(shí)驗(yàn)中鈣結(jié)節(jié)形成時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道有差異［8］，這可能與細(xì)胞接種密度及3種誘導(dǎo)劑濃度差異有關(guān)。

在細(xì)胞培養(yǎng)中，ALP是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，是成骨細(xì)胞標(biāo)志酶之一［12］;而骨礦化結(jié)節(jié)可作為成骨細(xì)胞分化的中期指標(biāo)，被認(rèn)為在維持正常骨鈣化率和抑制軟骨鈣化中起作用［11］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用這兩項(xiàng)基本指標(biāo)，考察分化細(xì)胞的成骨特性。在實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)BMSCs僅有少量ALP陽(yáng)性細(xì)胞，培養(yǎng)10 d時(shí)僅占28．14% ±5．38%，茜素紅染色未發(fā)現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié);而誘導(dǎo)的BMSCs，ALP陽(yáng)性細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增多，10 d陽(yáng)性率達(dá)88．34% ±8．65%，在13 d時(shí)有顯著密集的鈣化結(jié)節(jié)。這表明Dex、β-甘油磷酸鈉、Vit-C體外誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化良好，并已獲得成熟成骨細(xì)胞的表型特征。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所采用的體外分離培養(yǎng)法，經(jīng)Dex、β-甘油磷酸鈉、Vit-C 聯(lián)合誘導(dǎo)后，BMSCs能穩(wěn)定地向具有成骨細(xì)胞特征的細(xì)胞分化，并能體外成骨，可作為成骨細(xì)胞的一種來(lái)源，但在真正應(yīng)用于臨床之前還有許多亟待解決的問(wèn)題［13，14］，仍需進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)它的穩(wěn)定性和安全性。

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