外源性硫化氫對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

唐彩霞，張樹友，何英新，李 興，周壽紅

(1南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽421002;2南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤，在育齡婦女中發(fā)病率高達(dá)20% ～30%［1］。目前，研究認(rèn)為它是一種雌激素依賴性腫瘤［2］。硫化氫(H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子，廣泛分布于心血管、內(nèi)臟和神經(jīng)系統(tǒng)等［3］。研究顯示，內(nèi)源性或外源性H2S在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡［4］。而H2S是否影響子宮肌瘤增殖和凋亡，是否參與了子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展值得關(guān)注。因此，本研究應(yīng)用硫氫化鈉(NaHS)作為H2S供體處理人子宮肌瘤細(xì)胞，探討了外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其機(jī)制，為子宮肌瘤的治療探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1．1 材料 NaHS、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶和四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，美國(guó));DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國(guó))，胎牛血清(杭州四季青，中國(guó));Hot Star Taq Master Mix試劑盒和MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen，美國(guó))。兔抗人p53和Bcl-2單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Santa Cruz，美國(guó))，PCR 引物(上海生工，中國(guó))。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和流式細(xì)胞測(cè)定儀(Becton-Dickinson，美國(guó))，Bio-Rad550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad，美國(guó))，電子天平(Satorius，日本)，低溫高速離心機(jī)(Ependorff，美國(guó))。ABI7500型熒光定量PCR儀及分析軟件(ABI公司，美國(guó));垂直電泳儀與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(BioRad，美國(guó));GOS7500型凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP，美國(guó))。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 在無菌條件下，將手術(shù)切除的新鮮肌瘤組織用含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的PBS液沖洗3遍，剪碎至體積＜1 mm3。剪碎的肌瘤組織用含Ⅰ型膠原酶(800 U/mL)的DMEM培養(yǎng)液于37℃消化6 h，每隔1 h吹打1次。消化結(jié)束后，1 500 r/min離心10 min收集細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色，觀察細(xì)胞活性并進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/mL，接種于24孔培養(yǎng)板。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)免疫組化鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)每2～3 d傳代1次。取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，隨機(jī)分為為對(duì)照組和 10－5、10－4、10－3mol/L 的 NaHS 分別處理12、24、48 h 的觀察組。

1．2．3 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖影響的觀察 采用MTT法。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人子宮肌瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板。觀察組分別加入終濃度分別為 10－5、10－4、10－3mol/L的NaHS，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)12、24、48 h后，加入10μL MTT(5 mg/mL);繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，加入DMSO 0．1 mL。結(jié)晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定570 nm和630 nm雙波長(zhǎng)的吸光度(A)值。增殖抑制率=(對(duì)照組A值－觀察組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1．2．4 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率影響的觀察 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮肌瘤細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，觀察組分別加入終濃度為10－5、10－4、10－3mol/L 的 NaHS，每組設(shè) 3 個(gè)重復(fù)孔。分別培養(yǎng)12、24和48 h后，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液清洗2次，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后加入5μL Annexin V，再加入5μL的PI，混勻。室溫下、避光、反應(yīng)15 min后，上機(jī)檢測(cè)。Annexin V/PI染色陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比為細(xì)胞凋亡率。

1．2．5 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞中 p53和Bcl-2 mRNA表達(dá)影響的觀察 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代培養(yǎng)人子宮肌瘤細(xì)胞，分別加入 10－5、10－4、10－3mol/L 的 NaHS 培養(yǎng) 24 h后，或者10－4mol/L 的 NaHS分別培養(yǎng)12、24、48 h后，收集細(xì)胞。經(jīng)胰蛋白酶消化后，吹打收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用Trizol提取各組細(xì)胞的總RNA。以提取的總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。選取cDNA樣品10倍梯度稀釋后，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為30μL，包含 dNTP Mix(2×)8μL，cDNA 4 μL，上下游引物各1μL，用無菌去離子水補(bǔ)足30 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)為:95℃10 min激活Taq酶，94℃ 55 s，72℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。p53引物:上游:5'-GTTTCCGTCTGGGCTTCTTG-3'，下游:5'-CACAACCTCCGTCATGTGCT-3'。Bcl-2 引 物:上 游:5'-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3'，下游:5'-CCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3'。β-actin引物:上游:5'-ACACTGTGGCCCATCTACGAGG-3'，下游:5'-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3'。采用 2－△△CT法處理熒光定量PCR數(shù)據(jù)，以對(duì)照組為100%對(duì)目的基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。

1．2．6 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞中 p53和Bcl-2蛋白表達(dá)影響的觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的原代培養(yǎng)人子宮肌瘤細(xì)胞，分別加入 10－5、10－4和 10－3mol/L的 NaHS培養(yǎng) 24 h后，或者 10－4mol/L的NaHS分別培養(yǎng)12、24和48 h后，收集細(xì)胞。加入蛋白裂解液500μL裂解細(xì)胞40 min，20 000 r/min離心20 min，收集上清，提取細(xì)胞的總蛋白。BAC法進(jìn)行蛋白定量。100μL蛋白質(zhì)樣本加入到2×SDS凝膠緩沖液中，煮沸使蛋白質(zhì)充分變性。6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h分離蛋白質(zhì)，電壓為80 mV。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙稀膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果。10%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加入兔抗人 Bcl-2(1∶150)、p53(1∶200)和β-actin(1∶150)抗體，4℃下過夜。TBST緩沖液洗膜3次，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，4℃下孵育4 h，TBST緩沖液洗膜3次。蛋白質(zhì)印跡熒光檢測(cè)試劑盒顯示于X線片，顯影和定影后，凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描和半定量分析。

1．2．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響隨著外源性H2S濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)濃度和劑量依賴性(P均 ＜0．05)。見表 1。

2．2 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響觀察組隨著外源性H2S濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，呈現(xiàn)濃度和劑量依賴性(P 均 ＜0．05)。見表2。

表1 外源性H 2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響±s)

表1 外源性H 2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響±s)

NaHS(mol/L)細(xì)胞增殖抑制率(%)F P 10－5 12 h 24 h 48 h＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 6．83 ±0．75 9．32 ±1．27 13．34 ±2．01 7．15 ＜0．05 10 －4 17．22 ±2．89 22．71 ±3．46 31．42 ±4．15 8．64 ＜0．05 10 －3 26．58 ±3．17 29．28 ±3．04 38．33 ±3．47 9．52 ＜0．05 F 8．61 8．27 9．14 P

表2 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響(±s)

表2 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響(±s)

組別細(xì)胞凋亡率(%)0 h 12 h 24 h 48 h F P對(duì)照組 3．16 ±0．53 4．54 ±0．65 6．31 ±0．84 8．27 ±1．04 3．42 ＞0．05觀察組10 －5 mol/L 3．04 ±0．24 10．27 ±1．24 18．74 ±2．45 25．61 ±3．14 6．36 ＜0．05 10 －4 mol/L 4．12 ±30．38 19．62 ±2．73 35．15 ±5．02 51．37 ±6．45 7．84 ＜0．01 10 －3 mol/L 3．75 ±0．49 27．53 ±2．51 44．63 ±4．69 58．44 ±6．84 8．19 ＜0．01 F 0．97 4．53 7．44 8．32 P ＞0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．01

2．3 外源性H2S對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞中p53和Bcl-2表達(dá)的影響 與對(duì)照組(相對(duì)表達(dá)為1)比較，NaHS(10－5、10－4、10－3mol/L)處理 24 h 后 p53 mRNA 表達(dá)顯著增加(相對(duì)表達(dá)分別是 1．34 ±0．16、1．87 ±0．20和 2．69 ±0．28)，呈濃度依賴性增加(P 均 ＜0．05)。10－4mol/L 的 NaHS 培養(yǎng) 12、24、48 h 后，人子宮肌瘤細(xì)胞中p53 mRNA的相對(duì)表達(dá)分別是1．37±0．15、1．89 ±0．18 和2．73 ±0．29，呈時(shí)間依賴性增加(P均＜0．05)。與對(duì)照組(相對(duì)表達(dá)為1)比較，NaHS(10－5、10－4、10－3mol/L)處理24 h 后 Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著降低(相對(duì)表達(dá)分別是0．79 ±0．09、0．51±0．06和0．16 ±0．02)，呈濃度依賴性降低(P 均 ＜0．05)。10－4mol/L 的 NaHS 培養(yǎng) 12、24、48 h 后，人子宮肌瘤細(xì)胞中Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)分別是0．81±0．09、0．49 ±0．07 和 0．17 ±0．03，呈時(shí)間依賴性降低(P均＜0．05)。蛋白表達(dá)的結(jié)果見插頁Ⅱ圖3，觀察組隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，p53蛋白的表達(dá)逐漸增加(P均＜0．05)，而Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸降低(P均＜0．05)。

3 討論

子宮肌瘤是女性生殖器系統(tǒng)中最常見的良性腫瘤之一，臨床表現(xiàn)主要為子宮增大、陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)異常、腹痛、不孕、流產(chǎn)、鄰近器官壓迫癥狀等。有2/3的子宮肌瘤患者可沒有明顯癥狀，往往是通過體檢偶爾發(fā)現(xiàn)［5］。子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)理以及發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，尚不完全清楚。目前研究認(rèn)為，子宮肌瘤是一種激素依賴性疾病，雌孕激素在子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，雌孕激素有誘發(fā)并促進(jìn)子宮肌瘤生長(zhǎng)的作用。雌孕激素受體的高表達(dá)是公認(rèn)的子宮肌瘤細(xì)胞生物學(xué)特性之一［6］。子宮肌瘤是導(dǎo)致子宮切除的主要原因之一，嚴(yán)重危害了婦女的身心健康。因此，尋找新的治療途徑具有十分重要的意義。

研究表明，H2S和NO、CO一樣，符合作為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間信使物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，被認(rèn)為是第3種氣體信號(hào)分子。H2S可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中經(jīng)胱硫醚β合成酶、胱硫醚1裂解酶和半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶等催化產(chǎn)生［7］。H2S在體內(nèi)存在有兩種形式，即氣體H2S和NaHS形式。NaHS在體內(nèi)液體環(huán)境中可離解為鈉離子和硫氫根離子，而硫氫根離子與體內(nèi)的氫離子結(jié)合生成H2S，H2S和NaHS之間形成一種動(dòng)態(tài)平衡［8］。NaHS比H2S更容易保證溶液中H2S濃度的穩(wěn)定和準(zhǔn)確度，因此常使用NaHS作為外源性H2S的供體。H2S的生理和病理生理作用目前尚未完全闡明，它不僅在生理?xiàng)l件下參與了許多機(jī)體生理功能的調(diào)節(jié)，而且還參與許多疾病的病理過程［9，10］。

子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展與子宮肌瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的異常密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡進(jìn)行干預(yù)是目前腫瘤治療的一種新策略。H2S可以對(duì)多種細(xì)胞的增殖和凋亡有調(diào)節(jié)作用，一方面可以通過活化細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖，另一方面可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，其效應(yīng)與H2S的劑量和細(xì)胞類型有關(guān)［11，12］。本研究結(jié)果顯示，NaHS以濃度依賴的方式抑制人子宮肌瘤細(xì)胞的增殖促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。p53和Bcl-2蛋白是重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，p53是重要的腫瘤抑制基因，能與DNA特異結(jié)合，控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)［13，14］。Bcl-2 是細(xì)胞凋亡線粒體途徑中重要的調(diào)節(jié)因子，Bcl-2可通過多種途徑抑制凋亡的發(fā)生，是重要的抗凋亡基因［15］。我們的研究結(jié)果顯示，NaHS以濃度依賴的方式上調(diào)了人子宮肌瘤細(xì)胞中p53 mRNA和蛋白表達(dá)水平，而下調(diào)了Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)。

總之，我們的研究闡明，外源性H2S可抑制人子宮肌瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，該作用可能與H2S上調(diào)p53的表達(dá)而下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

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