抗人結(jié)締組織因子人源單鏈抗體的篩選、表達(dá)及活性鑒定

周 云，包 林，金 秋，張 黎，蔡雪婷，盧悟廣，曹 鵬，焦永軍，張建平

(1南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南京210011;2衛(wèi)生部腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省疾病預(yù)防控制中心病原微生物研究所;3江蘇省中醫(yī)藥研究院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是典型CCN家族(Cyr61，CTGF，Nov)中的一員，其主要功能有促進(jìn)細(xì)胞的遷徙、黏附、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生成以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、分化、傷口的愈合［1］。CTGF存在于許多人體組織中，主要由皮膚成纖維細(xì)胞、腎小球系膜、肝星狀細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成分泌［2］。CTGF具有明顯的有絲分裂原性和趨化性，可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，在多種組織器官(如腎、肝、肺、皮膚等)纖維化的進(jìn)程中起重要作用［3～5］。除了促進(jìn)一些組織器官纖維化外，CTGF在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［6～9］。目前，針對(duì) CTGF的單克隆抗體治療胰腺癌已應(yīng)用于裸鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，其對(duì)糖尿病腎病的治療也進(jìn)入一期臨床試驗(yàn)，都取得了良好的效果。因此，CTGF的特異性抗體應(yīng)用于臨床治療具有廣闊的前景。2012年4～10月，我們通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選出了高親和力的抗CTGF單鏈抗體，為臨床CTGF相關(guān)疾病的研究和靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 人源ScFv抗體文庫(kù)由本實(shí)驗(yàn)室建立并保存;重組人源TGF(rh-CTGF)購(gòu)自英國(guó)PeproTech公司，大腸桿菌XLI-Blue、Top10F'、輔助噬菌體VCSM13購(gòu)自Stratagene公司;HRP標(biāo)記的抗M13抗體購(gòu)自GE Healthcare公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，SV40 MES13(小鼠腎小球系膜細(xì)胞)購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，MHCC97H肝癌細(xì)胞系購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝癌研究所。Millicell(8μm，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1．2 方法

1．2．1 抗CTGF噬菌體抗體的篩選 將含有人源ScFv基因的抗體庫(kù)質(zhì)粒 ScFv-pComb3xSS電轉(zhuǎn)化XL1-Blue大腸桿菌，加輔助噬菌體M13KO7超感染制備噬菌體抗體文庫(kù);把該文庫(kù)加入到包被有rh-CTGF酶標(biāo)板中，37℃孵育2 h;PBST充分洗滌后，用Glycine-HCl(pH 2．2)洗脫。擴(kuò)增陽(yáng)性噬菌體抗體克隆，并進(jìn)行下一輪篩選。共進(jìn)行3輪篩選。計(jì)算每一輪篩選的洗脫與投入克隆的比例，觀察篩選的富集程度。

1．2．2 CTGF特異性抗體克隆的鑒定 第3輪篩選后獲得的噬菌體抗體克隆感染XLI-Blue后直接鋪板(含氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日共挑200個(gè)單克隆分別置于LB培養(yǎng)基中，加入VCSM13輔助噬菌體超感染制備單克隆噬菌體抗體。離心后把含噬菌體抗體的上清液加入包被有rhCTGF的96孔酶標(biāo)板，37℃孵育2 h;洗滌后加入HRP標(biāo)記抗M13二抗，37℃孵育1 h;充分洗滌后加入HRP底物，室溫作用30 min;每孔加H2SO4終止反應(yīng)，于450 nm測(cè)吸光度。陽(yáng)性克隆抽提噬粒DNA，對(duì)其編碼ScFv的基因片段測(cè)序。

1．2．3 ScFv陽(yáng)性克隆的表達(dá)、純化 經(jīng) Phage-ELISA和DNA測(cè)序鑒定的陽(yáng)性克隆，將其噬粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F'進(jìn)行表達(dá)。挑單菌落置10 mL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日用1 000 mL LB培養(yǎng)基1∶100稀釋過(guò)夜培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)約6 h至A600nm=1．0，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，25℃ 誘導(dǎo)過(guò)夜。離心收集菌體沉淀，用6His親和層析Binding buffer重懸后置超聲波破碎菌體;離心取上清，過(guò)0．45μm微孔濾膜，進(jìn)行鎳柱親和層析純化。純化的蛋白行SDS-PAGE觀察純度。用含8 mol/L尿素的Binding buffer重懸后，置超聲波破碎菌體;超聲裂解后，加1%Triton-100乳化;再次離心后收集上清，上His Trap親和層析柱進(jìn)行純化;將洗脫目的蛋白稀釋10倍后，用含有尿素的透析液進(jìn)行透析復(fù)性，復(fù)性的尿素濃度梯度依次為 4、2、1、0．5、0．25、0．125 mmol/L(pH 7．5);透析完成后超濾管3 000 g濃縮蛋白，測(cè)定濃度后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1．2．4 ScFv結(jié)合活性的鑒定 采用ELISA法。用rhCTGF包板，加入重組ScFv抗體分子，同時(shí)用腸道病毒71型病毒(EV71)特異性ScFv作為陰性對(duì)照，于37℃孵育2 h;充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的抗6His標(biāo)簽抗體(表達(dá)的抗 rhCTGF和抗 EV71的ScFv均帶有6His標(biāo)簽)，37℃孵育1 h;充分洗滌后，加底物室溫顯色30 min，加入1 mol/L H2SO450 μL/孔終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀讀A450nm值。

1．2．5 Millicell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 大量研究表明，腎小球系膜細(xì)胞可在多種因素影響下改變CTGF的表達(dá)量，且其細(xì)胞膜表面的CTGF受體使其對(duì)胞外活化CTGF的濃度相當(dāng)敏感［10，11］。因此，我們選用小鼠腎小球系膜細(xì)胞的Millicell遷移實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證胞外活化CTGF濃度。小鼠腎小球系膜細(xì)胞SV40 MES13在不含血清的DMEM/F12(3∶1)培養(yǎng)基內(nèi)饑餓12 h，胰酶消化后用含0．1%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1．0×105/100μL加入上室。下室加入 600μL含 rhCTGF(550 ng/mL)+CTGF ScFv抗體(0、10、50、100 μg/mL)的 0．1%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基，以EV71 ScFv作為抗體的陰性對(duì)照，以BSA作為CTGF的空白對(duì)照，常規(guī)培養(yǎng)20 h。棉簽拭去上室內(nèi)細(xì)胞，把膜風(fēng)干，0．1%結(jié)晶紫染色10～30 min;顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，計(jì)算遷移率(rhCTGF刺激組遷移率計(jì)為100%)。將基質(zhì)膠按40μL/孔均勻地鋪在 Millicell膜上，37℃成膠30 min，置紫外燈照射過(guò)夜。待培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，分別用空白、含EV71 ScFv 50μg/mL、含CTGF ScFv 50μg/mL DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液(含0．1%BSA)稀釋處理;2．0×105個(gè)細(xì)胞分別接種到鋪有基質(zhì)膠的上室內(nèi)，下室加入5%FBS/DMEM，常規(guī)培養(yǎng)24 h，其余步驟同遷徙實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 抗體文庫(kù)的篩選 以rhCTGF包板進(jìn)行3輪循環(huán)的吸附—洗脫—擴(kuò)增，其洗脫與投入克隆的比例在逐輪升高(表1)，說(shuō)明CTGF特異性抗體克隆在不斷地富集。

表1 ScFv抗體文庫(kù)對(duì)rhCTGF的富集篩選

2．2 Phage-ELISA和陽(yáng)性克隆測(cè)序 隨機(jī)挑取的200個(gè)克隆，第3輪篩庫(kù)洗脫克隆中有8個(gè)克隆Phage-ELISA 陽(yáng)性，分別 1C5、1B9、1E2、2B4、2C10、2E9、2F5、2H1，其 A450nm值分別為 1．3、1.0、1.1、1.1、0.9、0.8、1.3、1.1，陰性對(duì)照為 0.1;DNA 測(cè)序結(jié)果表明這8個(gè)克隆為同一個(gè)克隆，被命名為1C5，其序列具有單鏈抗體特點(diǎn)。

2．3 單鏈抗體1C5的表達(dá)、純化 1C5的可溶性表達(dá)只存在于菌體中，用硫酸鎳親和層析柱進(jìn)行純化，在SDS-PAGE上其相對(duì)分子量約為34 kD，其最終表達(dá)產(chǎn)量可達(dá)5 mg/L。見(jiàn)插頁(yè)Ⅱ圖1。

2．4 ELISA檢測(cè)1C5與CTGF的結(jié)合活性 與空白及陰性對(duì)照(A450nm分別為0．08和0．14)相比，1C5的A450nm為1．33，說(shuō)明其能與CTGF有很好的結(jié)合。

2．5 1C5 ScFv對(duì)CTGF功能的抑制作用 經(jīng)過(guò)饑餓12 h的小鼠腎小球系膜細(xì)胞在rhCTGF的誘導(dǎo)下可以增強(qiáng)遷徙性而向下室移動(dòng)。下室中1C5 ScFv在3個(gè)濃度梯度下中和rhCTGF活性，與空白對(duì)照相比，10、50、100 μg/mL 依次降低至 54．3%、14．7%、13．3%，確定1C5 ScFv濃度50 μg/mL 為小鼠腎小球系膜細(xì)胞Millicell遷移實(shí)驗(yàn)適宜濃度。

2．6 Millicell遷移實(shí)驗(yàn) 將下室含rhCTGF 550 ng/mL的遷移率定為100%，而空白對(duì)照(BSA)的遷移率僅為3．5% ±0．5%。1C5 ScFv(50 μg/mL)抑制了rhCTGF對(duì)細(xì)胞的刺激作用，其遷移率降為14．7% ±2．6%，而抗 EV71的 ScFv對(duì) rhCTGF則無(wú)抑制作用，細(xì)胞遷移率為80．1% ±5．6%，說(shuō)明1C5對(duì)CTGF具有中和作用。

3 討論

CTGF最早由Bradham等［12］用親和色譜法在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的，是一種相對(duì)分子量為38 kD的富含半胱氨酸分泌性生長(zhǎng)因子，屬于即刻早期基因、高度保守的CCN多肽家族。CTGF有4個(gè)主要蛋白結(jié)構(gòu)區(qū):胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白區(qū)、von Willebrand因子C型重復(fù)區(qū)、血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)區(qū)以及生長(zhǎng)因子半胱氨酸群［13］，由多個(gè)功能單位組成。CTGF通過(guò)截?cái)嗖煌Y(jié)構(gòu)域而在體內(nèi)有多種存在形式，且多種因素調(diào)節(jié)CTGF的表達(dá)［14］，因此，其發(fā)揮生物學(xué)作用的機(jī)制較為復(fù)雜。

大量研究表明，CTGF在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中主要通過(guò)TGF-β通路發(fā)揮作用［15］，但這并非其所有機(jī)制。CTGF的其他結(jié)構(gòu)域通過(guò)與各種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞表面受體之間的相互作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。結(jié)構(gòu)域Ⅰ可以結(jié)合胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ/Ⅱ，結(jié)構(gòu)域Ⅱ可以結(jié)合VEGF，結(jié)構(gòu)域Ⅳ可以結(jié)合類肝素硫酸蛋白聚糖和結(jié)合素類。因此，CTGF作用于其他生長(zhǎng)因子及細(xì)胞表面受體而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系MHCC97H表達(dá)較高的CTGF［15］，其Millicell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組細(xì)胞侵襲率為97% ±6．1%，而處理組顯著下降至36% ±4．7%(空白對(duì)照侵襲能力設(shè)為100%)。通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)抑制CTGF的表達(dá)可以降低肝細(xì)胞肝癌的增殖，進(jìn)而純化CTGF特異性抗體做進(jìn)一步研究。本研究中我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化出的ScFv結(jié)合CTGF的特定結(jié)構(gòu)域，以抑制其促細(xì)胞遷徙能力。下一步研究將通過(guò)鑒定本株ScFv針對(duì)的結(jié)構(gòu)域來(lái)確定CTGF促細(xì)胞遷徙的具體結(jié)構(gòu)域。

抗體介導(dǎo)的靶向治療，是腫瘤生物治療最具潛能的治療手段。目前，單純依賴抗體的靶向治療主要機(jī)制有拮抗作用、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用(CDC);體外的Millicell遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，純化的ScFv具有拮抗活性，通過(guò)對(duì)ScFv全分子化可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，通過(guò)ADCC和CDC等多種機(jī)制協(xié)同效應(yīng)特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。由于腫瘤的抗體靶向治療需要多次給藥，人體對(duì)鼠源、嵌合抗體極易產(chǎn)生抗體，從而影響單克隆抗體治療效果;我們篩選人源ScFv抗體文庫(kù)得到全人源抗體，由其得到的全分子化抗體將很好地解決了這一問(wèn)題。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了制備的單鏈抗體可以特異性靶向CTGF，且能中和其活性，具有應(yīng)用于臨床治療的潛能。但能否通過(guò)特異性抗CTGF抗體降低組織器官微環(huán)境中CTGF的表達(dá)，進(jìn)而阻礙組織器官纖維化的進(jìn)展和影響腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲，還需要接下來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床病例對(duì)照試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究。

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