胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物修復(fù)兔半月板無血運(yùn)區(qū)損傷

于書記，姜鑫

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室;2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬濰坊市人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，山東 濰坊 261053)

近年來，大量行半月板部分或全部切除術(shù)的患者較早的出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)退變性骨關(guān)節(jié)炎［1－2］，預(yù)后很不樂觀，提示半月板在膝關(guān)節(jié)運(yùn)動負(fù)重、緩沖震蕩和維持穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要的生物力學(xué)功能、扮演著極其關(guān)鍵而特殊的角色［3－4］。因此現(xiàn)階段對于半月板損傷后修復(fù)的研究顯得尤其重要和必要!

實(shí)驗(yàn)研究［5－6］證實(shí)胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF－Ⅰ，Insulin－like growth factor I)對體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞等多種組織細(xì)胞有顯著的促增殖作用，且研究顯示Ⅰ型膠原具有良好的生物相容性，可作為組織損傷修復(fù)的支架材料，而目前用胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物(IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物)修復(fù)半月板損傷的研究報道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物對兔半月板無血運(yùn)區(qū)損傷的修復(fù)效果，為臨床半月板無血運(yùn)區(qū)損傷的修復(fù)探索新的途徑。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計(jì)

隨機(jī)分組，對比觀察。

1.2 時間及地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2011 年8 月至2012 年10 月在濰坊醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年新西蘭大白兔36 只，雌雄不限，體質(zhì)量2.2～2.8 kg，由濰坊醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置參照國家科學(xué)技術(shù)部2006 年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》［7］。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料

IGF－Ⅰ，Ⅰ型膠原溶液(武漢博士德生物工程有限公司);光鏡及HE 染色試劑由濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物的制備

既往研究表明體外培養(yǎng)半月板、軟骨等組織細(xì)胞時，IGF－Ⅰ在50 μg/L 濃度時具有最大促增殖效應(yīng)。用雙腔注射器抽取等量的質(zhì)量濃度為50 μg/L IGF－I 溶液和I 型膠原溶液制成復(fù)合物注射于治療部位。

1.5.2 動物模型建立

將健康成年新西蘭大白兔36 只按隨機(jī)數(shù)字法均分為3 組，并于實(shí)驗(yàn)前8 小時禁食，自由飲水。用2.5%戊巴比妥鈉(2.5 mg/kg)于兔耳緣靜脈注射全麻;麻醉后仰臥位固定四肢，雙后肢膝部脫毛，常規(guī)碘酊、酒精消毒，鋪無菌巾。屈膝90°，取雙膝關(guān)節(jié)髕韌帶外側(cè)手術(shù)入路(防止術(shù)后尿液污染導(dǎo)致切口感染)約2 cm 弧形切口，沿髕骨外上緣至脛骨結(jié)節(jié)處切開皮膚及皮下各層，用自制的半月板拉鉤顯露外側(cè)半月板前角、體部及股骨髁軟骨面。參照相關(guān)文獻(xiàn)［8］，用鐮狀刀片于外側(cè)半月板游離緣體部造成一個長0.7 cm、寬0.3 cm 的統(tǒng)一的無血運(yùn)區(qū)縱行全層裂傷模型。

1.5.3 隨機(jī)分組

空白對照組中半月板損傷區(qū)不作任何填塞處理，IGF－Ⅰ組半月板損傷區(qū)內(nèi)注射1 mL IGF－Ⅰ溶液(配制50 μg/L 的濃度);IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組半月板損傷區(qū)注入胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物至填充劑與半月板表面相平為止。然后用3.0 尼龍線緊密縫合關(guān)節(jié)囊以防液體滲出，抗生素敷料包扎。

1.5.4 術(shù)后處理

術(shù)后每只兔每天肌注青霉素8 萬單位，連續(xù)5 d，預(yù)防感染。自制小夾板固定膝部2 周，限制關(guān)節(jié)活動。分籠飼養(yǎng)，連續(xù)觀察進(jìn)食、活動、切口有無紅腫及滲液等情況。分別于術(shù)后第4、8、12 周，分批隨機(jī)選取3 組中各4 只實(shí)驗(yàn)動物，從耳緣靜脈行空氣栓塞法處死，打開關(guān)節(jié)腔，切取半月板組織標(biāo)本并無菌保存。

1.5.5 觀察指標(biāo)

將半月板標(biāo)本進(jìn)行大體形態(tài)觀察后，置入體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛溶液中固定2～3 d，再進(jìn)行脫水、浸蠟包埋處理，最后對切片采用蘇木精—伊紅染色，行光鏡下組織學(xué)檢查。

1.5.6 設(shè)計(jì)、實(shí)施、評估者

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、干預(yù)實(shí)施為第一作者，評估為第二作者;實(shí)驗(yàn)實(shí)施者接受正規(guī)培訓(xùn)，評估者采用盲法評估。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

觀察3 組中36 只實(shí)驗(yàn)兔，手術(shù)后膝關(guān)節(jié)均無切口感染及關(guān)節(jié)積液，無半月板與關(guān)節(jié)面軟骨粘連;空白對照組及IGF－Ⅰ組半月板損傷區(qū)3 個時間點(diǎn)均未愈合、未見組織填充(圖1)，IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組的半月板裂口在第12 周時均已被組織填充;愈合組織的顏色較正常半月板組織深，裂口較術(shù)前變窄，其表面稍向內(nèi)陷，愈合組織與鄰近半月板組織粘連緊(圖2)。

2.2 組織學(xué)檢查

空白對照組:術(shù)后各觀察期裂口邊緣均無纖維軟骨細(xì)胞或成纖維細(xì)胞增殖。IGF－Ⅰ組:術(shù)后4 w，半月板邊緣滑膜細(xì)胞少量增生;術(shù)后8 w，半月板邊緣滑膜細(xì)胞顯著增生，半月板裂口未見愈合跡象;術(shù)后12 w，裂隙處仍無纖維軟骨細(xì)胞增殖，亦無同源細(xì)胞群出現(xiàn)。

IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組:術(shù)后第4 周，鏡下見缺損處被膠質(zhì)樣組織充填，可見少量纖維組織與正常組織交織，裂隙兩邊有纖維軟骨細(xì)胞增殖表現(xiàn)，修復(fù)組織內(nèi)尚未見明顯纖維軟骨細(xì)胞(圖3);術(shù)后第8 周，鏡下見纖維樣組織形成，并與周圍正常組織相連，纖維排列不規(guī)則，可見散在的纖維軟骨細(xì)胞生長，無軟骨囊形成(圖4);術(shù)后第12 周，鏡下見整個缺損區(qū)均已被纖維軟骨樣組織填充，愈合組織內(nèi)見較多纖維軟骨細(xì)胞形成，部分可見軟骨囊或軟骨陷窩，膠原纖維排列較前規(guī)則，接近于正常的半月板組織(圖5)。另有少數(shù)標(biāo)本表現(xiàn)為瘢痕樣組織愈合，未見纖維軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，纖維排列欠規(guī)則，愈合組織與正常半月板的組織學(xué)特征有明顯差異(圖6)。

3 討 論

3.1 半月板的生理分區(qū)及損傷的治療進(jìn)展

半月板在臨床上根據(jù)血運(yùn)供應(yīng)、承受機(jī)械應(yīng)力以及解剖部位不同一般被分為3 個區(qū):紅區(qū)、白區(qū)和紅一白區(qū)。紅區(qū)位于半月板滑膜緣，又稱有血運(yùn)區(qū);白區(qū)位于半月板游離緣，又稱無血運(yùn)區(qū);紅—白區(qū)為紅區(qū)向白區(qū)過渡部分，由紅區(qū)毛細(xì)血管終末支供血。既往研究表明［9］，無血運(yùn)區(qū)營養(yǎng)主要來自滑液，損傷后不能自行修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中空白對照組整個觀察期始終沒有愈合的反應(yīng)，與這一普遍結(jié)論是相符的，這可能與半月板游離緣大部分區(qū)域沒有血供缺乏營養(yǎng)支持及半月板軟骨細(xì)胞自身的增殖惰性等多種因素有關(guān)。近年來半月板鉆孔建立血管通道［10］、凝血塊移植、滑膜移植等治療半月?lián)p傷均有大量研究，取得了一定程度的進(jìn)展。而當(dāng)前對組織工程半月板的研究成為熱點(diǎn)，其中以種子細(xì)胞［11］、支架材料和細(xì)胞因子的研究居多。本實(shí)驗(yàn)即研究以胰島素樣生長因子Ⅰ與Ⅰ型膠原材料相結(jié)合修復(fù)兔半月板損傷的效果，結(jié)果顯示胰島素樣生長因子Ⅰ在Ⅰ型膠原作為生物支架材料存在時可有效刺激活體兔半月板纖維軟骨細(xì)胞的增殖，IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物對兔半月板無血運(yùn)區(qū)的損傷在一定程度上具有較好的修復(fù)作用，這為臨床半月板無血運(yùn)區(qū)損傷的修復(fù)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提供了一種相對可行的參考方法。

3.2 GF－Ⅰ的生物特性及在半月板損傷愈合中的作用

研究表明［12］，IGF－Ⅰ對成骨細(xì)胞的增殖和分化及骨代謝的調(diào)節(jié)也有重要作用，是骨塑形改建過程中的重要調(diào)節(jié)因子，刺激成骨前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)Ⅰ型膠原和骨基質(zhì)的合成，促進(jìn)骨的生長和損傷的修復(fù)。經(jīng)研究證實(shí)［13］，IGF－Ⅰ是一種在體內(nèi)參與多種生理調(diào)節(jié)的多肽，可調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育和軟骨自穩(wěn)態(tài)，刺激軟骨細(xì)胞分裂增殖，并促進(jìn)軟骨蛋白聚糖的合成，維持軟骨細(xì)胞的表型，促進(jìn)軟骨愈合。

后有研究表明［14］，IGF－Ⅰ可以明顯促進(jìn)立體培養(yǎng)的半月板纖維軟骨細(xì)胞的增殖，尤其對于無血運(yùn)區(qū)的細(xì)胞促增殖效果更顯著。本實(shí)驗(yàn)中，IGF－Ⅰ組只對半月板邊裂口緣滑膜細(xì)胞有促增殖作用，而對無血運(yùn)區(qū)損傷的愈合卻無明顯影響，這可能與胰島素樣因子單獨(dú)存在時由于缺少生物支架材料的保護(hù)更容易被降解、稀釋等原因有關(guān)，也可能是由于增生的細(xì)胞數(shù)量較少，新生的細(xì)胞缺少纖維蛋白支架的支撐而不能移行生長，最終達(dá)不到愈合的目的。

3.3 Ⅰ型膠原在組織損傷愈合中的作用

Ⅰ型膠原是一種分布在骨、軟骨、肌腱、血管、皮膚等結(jié)締組織的含糖蛋白質(zhì)，作為天然的細(xì)胞外基質(zhì)，其結(jié)構(gòu)非常有利于培養(yǎng)中細(xì)胞的黏附、增殖和分化。Ⅰ型膠原為半月板基質(zhì)的主要成分，能有效促使半月板纖維軟骨細(xì)胞盡早黏附、維持表型、形成集落，并能刺激細(xì)胞分泌膠原等。研究結(jié)果［15］顯示:Ⅰ型膠原作為生長因子緩釋載體和基因治療的載體，具有良好的生物相容性，在半月板、關(guān)節(jié)軟骨等結(jié)締組織損傷的修復(fù)中有著廣闊的前景。

3.4 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物在半月板損傷愈合中的作用

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGF－ Ⅰ/Ⅰ型膠原復(fù)合物可增強(qiáng)IGF－Ⅰ的生物學(xué)活性，比單用IGF－Ⅰ的效果明顯要好，多數(shù)表現(xiàn)為纖維軟骨樣組織愈合。這提示半月板并非一定是完全惰性的組織，在適宜的條件刺激下，半月板無血運(yùn)區(qū)的損傷可產(chǎn)生纖維組織愈合。我們認(rèn)為:當(dāng)給予適當(dāng)?shù)纳L環(huán)境，并有種子細(xì)胞、支架材料、生長因子三者甚至更多因素的共同參與時，纖維軟骨細(xì)胞大量增殖及基質(zhì)蛋白充分合成等，半月板無血運(yùn)區(qū)損傷的愈合是可實(shí)現(xiàn)的。如果引入反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)技術(shù)，可更加確切的證實(shí)愈合組織為半月板組織。

期待在后續(xù)研究中，進(jìn)一步引入種子細(xì)胞或更多種生長因子，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行更深層次的探索，以期能獲得一種更理想的復(fù)合型組織工程材料，使半月板的損傷能在組織結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)功能上獲得雙重修復(fù)。

圖1 空白對照組及IGF－Ⅰ組未愈合

圖2 復(fù)合物組愈合且連接緊密

圖3 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第4 周膠質(zhì)樣組織充填 HE×100

圖4 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第8 周纖維樣組織填充 HE×100

圖5 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第12 周纖維軟骨樣組織 HE×100

圖6 IGF－Ⅰ/Ⅰ型膠原組術(shù)后第12 周瘢痕樣組織愈合 HE×100

［1］McDermott ID，Amis AA.The consequences of meniscectomy.［J］.Bone Joint Surg Br，2006，88 (12):1549－1556.

［2］Shiramizu K，Vizesi F，Bruce W，et al.Tibiofemoral contactareas and pressures in six high flexion knees.［J］.Int Orthop，2009，33 (2):403－406.

［3］Richards DP，Barber FA，Herbert MA.Compressive loads in longitudinal lateral meniscus tears:a biomechanical study in porcine knees.［J］.Arthroscopy，2005，21 (12):1452－1456.

［4］Andersson－Mo lina H，Karlsson H，Rockborn P.Arthorscopic par－tial and to meniscectomy:A long－term follow－up study with matched controls ［J］.Arthorscopy，2002，18 (2):183－189.

［5］Shi S，Mercer S，Tdppel SB.Effect of transfection strategy on growth factor over expression by atricular chondrocytes.［J］.Otrhop Res.2010，28 (11):103－109.

［6］Heckmann TP，Barber－Westin SD，Noyes FR.Meniscal repair and transplantation:indications， techniques， rehabilitation，and clinical outcome.［J］.Orthop Sports Phys Ther，2006，36 (10):795－814.

［7］中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部.關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見［S］.2006.

［8］Baksh D，Yao R，Tuan RS.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow ［J］.Stem Cells，2007，25 (6):1384－1392.

［9］Noyes FR，Barber－Westin SD.Repair of complex and avascular meniscal tears and meniscal transplantation ［J］.J Bone Joint Surg Am，2010，92 (4):1012－1029.

［10］Fox DB，Luther JK，Whitener D.An in vitro model to assess mechanisms and erricacy of a cellular conduit for treatment of avascular meniscal injuries ［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2008，44 (7):185－188.

［11］Pabbruwe MB，Kafienah W，Tarlton JF，et al.Repair of meniscal cartilage white zone tears using a stem cell collagen－scaffold implant ［J］.Biomaterials，2010，31 (9):2583－2591.

［12］Stabnov L，Kasukawa Y，Guo R，et a1.Effect of insulin－like growth factor－l (IGF－1)plus alendronate on bone density during puberty in IGF－ I－ deficient MIDI mice ［J］.Bone，2002，30 (6):909－916.

［13］Higgins TF，Johnson BD.Effect of exogenous IGF－ 1 on chondrocyte apoptosis in a rabbit intra articular ostetomy model［J］.Orthop Res，2010，28 (1):125－130.

［14］Tumia NS，Johnstone AJ.Regional regenerative potential ofmeniscal cartilage exposed to recom binant insulin－like growth factor－ I in vitro ［J］.Bone Joint Surg (Br)，2004，86(7):1077－1081.

［15］Kasemkijwattana C，Kesprayura S，Chaipinyo K，et al.Autologous chondrocytes implantation for traumatic cartilage defects of the knee ［J］.J Med ASSOC Thai，2009，92 (10):1282－1286.