正交設(shè)計(jì)優(yōu)選痹痛貼提取揮發(fā)油的水煎液的除雜工藝

奚建，李建利

痹痛貼是由獨(dú)活、川芎、肉桂、乳香、沒(méi)藥等藥材經(jīng)過(guò)提取、濃縮、成型等步驟制備的貼劑，具有活血化瘀，消腫止痛的功效，用于治療各種痹癥。方中獨(dú)活為君藥，其發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗炎、解痙、抗血栓作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)主要為香豆素類化合物，川芎、肉桂等藥材主含揮發(fā)油；乳香、沒(méi)藥[1]中發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抑制炎癥、抗血栓等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為樹(shù)脂成分。故筆者擬定了對(duì)方中川芎、肉桂等藥材先提取揮發(fā)油，提揮發(fā)油后的藥渣再與剩余藥材乙醇回流提取的工藝。由于傳統(tǒng)用藥都是水煎，故提取揮發(fā)油所得水提取液也應(yīng)作為處方藥效成分，但由于水煎液多含有蛋白質(zhì)、多糖、淀粉、黏液質(zhì)等雜質(zhì)，使藥效成分含量降低，影響療效；故本文主要對(duì)按試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取揮發(fā)油工藝后的水煎液進(jìn)行除雜研究，采用乙醇沉淀法，以藥液比、含乙醇量為考察因素，以醇浸膏收率和阿魏酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)表來(lái)安排實(shí)驗(yàn)，來(lái)優(yōu)化最佳工藝。

1 儀器與試藥

川芎、肉桂等藥材購(gòu)自四川科倫天然藥業(yè)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定，藥材符合《中國(guó)藥典》2010年版要求[2]，阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-200611）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純，純凈水(哇哈哈純凈水)，其余所用試劑均為分析純。

島津LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-20A 紫外檢測(cè)器）；METTLER TOLEDO電子天平(AB204-E)。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿魏酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件[2]色譜柱Kromasil C18（5μm，250×4.6mm）；流動(dòng)相甲醇-0.1%醋酸水（35：65）；流速1.0 mL.min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm。

2.1.2 方法專屬性考察 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蛇床子素對(duì)照品適量，用甲醇溶解制成15μg/ml的溶液即得。

供試品溶液的制備 分別精密吸取各樣品提取溶液5ml，揮干，用甲醇溶解，并定容至25ml容量瓶，取溶液適量微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，即得。

方法專屬性 分別精密吸取蛇床子素對(duì)照品溶液，供試品溶液各15μL，分別注入液相色譜檢測(cè)，阿魏酸對(duì)照品，供試品在9.5min左右出現(xiàn)阿魏酸吸收峰。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品（15μg/ml）溶液2、4、8、10、16μl，按上述色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：Y=1E+06X-272621（r=0.9997）。結(jié)果表明阿魏酸在0.03～0.24μg之間有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，以蛇床子素峰面積計(jì)算，RSD為0.86%。

2.1.5 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品5μL，分別在0，2，4，6，8，10 h測(cè)定峰面積，RSD為1.20%(n=6)，表明供試品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 阿魏酸含量測(cè)定 分別取“2.2”項(xiàng)下得到的9組供試品溶液，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，各精密吸取15μl，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算阿魏酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 正交試驗(yàn)

影響醇沉除雜效果的因素有藥液含醇濃度，初始藥液質(zhì)量濃度和靜置時(shí)間、醇沉次數(shù)等，參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)，并考慮到痹痛貼的提取工藝線路，選擇藥液含醇濃度和初始藥液質(zhì)量濃度為考察因素，并考慮兩因素交互作用，按表2進(jìn)行正交試驗(yàn)，以浸膏收率和阿魏酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。按L9(34)正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

將提揮發(fā)油水煎液濃縮至一定的質(zhì)量濃度，加入95%乙醇使藥液中乙醇達(dá)到一定濃度值，冷藏24小時(shí)，抽濾，濾液回收乙醇后定容至100mL，即得得1～9號(hào)樣品溶液，測(cè)定含量。分別吸取定容后的樣品溶液20 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，取出，迅速稱量，計(jì)算浸出物得率。結(jié)果見(jiàn)表2。

浸出物得率=醇沉后浸膏質(zhì)量/初始浸膏質(zhì)量×100%

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算表

表3 醇浸膏方差分析

表4 阿魏酸含量方差分析

2.3 結(jié)果分析

以浸膏得率為考察指標(biāo)，各因素作用主次為B＞A，方差分析表明B因素有顯著性影響，A×B無(wú)顯著性影響，說(shuō)明A與B無(wú)交互作用，醇沉后浸膏率以少為宜，故以A1B3為佳。以阿魏酸含量為考察指標(biāo)，各因素作用主次為A＞B，方差分析表明均無(wú)顯著性影響，以A1B2為佳?？紤]到阿魏酸含量的重要性，故最后選擇A1B2，即初始藥液質(zhì)量濃度為1.0～1.10g/ml，加95%乙醇醇沉，使含醇量達(dá)70%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按確定的除雜工藝進(jìn)行平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果3次試驗(yàn)浸膏得率分別為14.08%，14.13%，14.16%，平均值為14.12%；阿魏酸含量分別為2.03，2.32，2.45mg，平均值為2.27mg。表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的痹痛貼水提取液最佳醇沉工藝為初始藥液質(zhì)量濃度為1，加95%乙醇醇沉，使含醇量達(dá)70%，在此工藝條件下, 阿魏酸的含量較高和浸出物得率適中；對(duì)于影響乙醇醇沉的因素中，初始質(zhì)量濃度過(guò)高的藥液黏稠度高, 難以與乙醇充分接觸,析出的沉淀易包裹藥液而造成有效成分損失；初始質(zhì)量濃度過(guò)低則藥液量大, 耗費(fèi)乙醇, 延長(zhǎng)時(shí)間。因此選擇了1.0～1.10g/ml，1.10～1.15g/ml，1.15～1.20g/ml三個(gè)范圍的初始質(zhì)量濃度為考察指標(biāo)；對(duì)于藥液含醇濃度，濃度太低，乙醇用量大浪費(fèi)，回收不方便，且沉淀成絮狀，難以下沉，效果差；濃度太高，得到的醇提液較少，沉淀中含有大量的有效物質(zhì)，且加入高濃度乙醇，易造成局部濃度過(guò)高，形成大塊沉淀，將有效成分包裹，隨沉淀除去，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]，選擇藥液含醇量分別為50%、60%、70%三個(gè)水平考察對(duì)所測(cè)指標(biāo)的影響。另外預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)醇沉次數(shù)的研究表明，醇沉次數(shù)并無(wú)顯著影響，且從簡(jiǎn)化工藝、節(jié)約生產(chǎn)成本選擇醇沉一次。

[1] 徐艷.乳香、沒(méi)藥的炮制使用[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2004,10(5):317.

[2] 中國(guó)藥典.一部[S].2010:38,127.

[3] 玄律,倪健.多指標(biāo)優(yōu)選醒目顆粒水提醇沉制備工藝[J].中成藥雜志,2010,32(7):1238.