鋅預處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓鋅分布的影響

朱廣軍，張莉，郭敏

(1.遼寧醫(yī)學院組織胚胎學教研室，遼寧 錦州 121001;2.盤錦市第二人民醫(yī)院，遼寧 盤錦 124000)

神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)是繼發(fā)于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的一種慢性疾病狀態(tài)，以痛覺的高反應性如痛覺過敏、痛覺超敏、感覺缺失及自發(fā)疼痛等為主要臨床病理生理學特點［1－3］。隨著社會老齡化，該疾病的發(fā)病率逐年增高，嚴重影響了患者的生存質量。因此，深入研究NPP 的發(fā)病機制從而探索有效的治療措施已經(jīng)成為神經(jīng)科學研究的熱點之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鋅離子可能參與了NPP 的產(chǎn)生與維持，因此，為了深入研究鋅參與NPP 的可能機制，本研究擬應用金屬自顯影技術，原子吸收光譜技術和圖像分析技術檢測辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角鋅的分布變化，并且檢測鋅預處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角鋅分布的影響，從而為深入研究鋅參與NPP發(fā)病機制提供基礎的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

8 周齡C57/BL6 小鼠48 只，雌雄各半，體重30～40 g，隨機分為4 組: (1)對照組(Con):正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射生理鹽水;(2)N－CAP 組:正常喂養(yǎng)(鋅:30.0 mg/kg)2 w 后足底注射辣椒素 (0.5%，5 μL);(3)L－CAP組:低鋅喂養(yǎng)(鋅:0.85 mg/kg)2 w后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL);(4)H－CAP組:高鋅喂養(yǎng)(飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/L)2 w 后足底注射辣椒素(0.5%，5 μL)。

1.2 原子吸收光譜技術

術后7 d，各組小鼠麻醉后取新鮮的腰5 節(jié)段脊髓組織，微波熱能消化脊髓組織，3000 r/min離心10 min 后取上清液，進行原子吸收光譜檢測。

1.3 金屬自顯影技術

小鼠腹腔注射硒酸鈉(20 mg/kg)，存活1.5 h后將動物麻醉，2.5%的戊二醛經(jīng)心臟灌流固定，取腰5 節(jié)段脊髓。后固定3 h，30%蔗糖4 ℃過夜，恒冷切片機制備10 μm 冰凍切片。切片置于孵育液(60 mL 阿拉伯膠、10 mL 檸檬酸緩沖液、15 mL對二苯酚和15 mL 乳化銀)，26 ℃孵育60 min。常規(guī)脫水、透明和封片，光鏡下觀察。

1.4 圖像分析與統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 原子吸收光譜檢測結果

原子吸收光譜檢測結果顯示，與對照組(Con組)比較，NPP 小鼠脊髓的鋅含量均顯著減少(P＜0.01)，高鋅預處理(H－NPP 組)能提高脊髓的鋅含量(P ＜0.01)，低鋅預處理(H－NPP 組)則加重脊髓的缺鋅狀態(tài)(P ＜0.01)(圖1)。

2.2 金屬自顯影技術染色結果

金屬自顯影染色陽性反應產(chǎn)物為棕黑色顆粒狀。與對照組(Con 組)相比，H－CAP 組脊髓背側角淺層的鋅離子顯著增多(P ＜0.01);而N－CAP 組和L－CAP 組脊髓背側角淺層的鋅離子均顯著減少(P ＜0.01)。其中，L－CAP 組脊髓背側角淺層的鋅離子顯著低于N－ CAP 組(P ＜0.01)(圖2)。

2.3 圖像分析結果

圖像分析顯示，與對照組(Con 組)比較，H－CAP 組的吸光度值顯著降低(P ﹤0.01)，N－CAP 組和L－ CAP 組的吸光度值顯著增加(P ﹤0.01)，其中L－ CAP 組的吸光度值最高(P ﹤0.01)(圖3)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，NPP 的發(fā)病機制復雜，發(fā)病原因多樣，近年來由于癌癥等疾病的生存率提高，因此導致NPP 的發(fā)病率顯著增加，高達1%［4－5］。NPP 通常呈慢性，可持續(xù)數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年，嚴重影響患者的生活質量。由于NPP 的臨床治療目前仍缺乏有效措施，因此，仍需深入探討NPP 的發(fā)病機制，從而為尋找NPP 治療的有效方法而提供基礎的實驗依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，鋅是機體重要的微量元素，它廣泛分布于各種組織和器官中［6］，在大腦、小腦、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和頸上神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)系統(tǒng)中的分布尤其豐富［7－8］。這些鋅離子主要分布于神經(jīng)元胞體的核周質中或者是軸突終末的突觸小泡內(nèi)，參與蛋白質的合成或者伴隨神經(jīng)遞質或神經(jīng)調質的釋放，從而可在神經(jīng)活動中發(fā)揮著重要的作用。近年來的實驗研究表明，鋅可能與NPP 的產(chǎn)生與傳遞有著密不可分的關系。有研究［9－10］發(fā)現(xiàn)，鋅離子能影響非NMDA 受體的表達與功能，而這個受體在傷害性刺激傳導過程中起著非常重要的作用。Jo等［11］將動物的脊神經(jīng)背根切斷，用金屬自顯影技術發(fā)現(xiàn)在脊髓背側角的淺層，鋅離子的分布顯著減少，同時伴隨小鼠機械痛閾值的降低，小鼠出現(xiàn)痛覺過敏現(xiàn)象，推斷鋅可能參與了痛覺的傳導。本研究中利用原子吸收光譜技術和金屬自顯影技術也發(fā)現(xiàn)，足底注射辣椒素后，小鼠脊髓組織中的鋅顯著減少，脊髓后角淺層的AMG 陽性顆粒顯著減少，分析可能是由于辣椒素致痛時，大量鋅離子伴隨著神經(jīng)遞質在脊髓后角淺層釋放，從而造成鋅耗竭。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，缺鋅可以使NPP 模型動物的機械性痛閾值降低，動物出現(xiàn)痛覺過敏和痛覺超敏現(xiàn)象，提示NPP 時引起的脊髓后角淺層缺鋅可能是導致異常痛的原因。那么給予鋅預處理是否能改變脊髓后角中的鋅的分布呢?本實驗給予動物高鋅或低鋅預處理，結果發(fā)現(xiàn):當給予高鋅預處理時，NPP 模型動物脊髓中的鋅含量增高;而給予低鋅預處理時，NPP 模型動物脊髓中的鋅含量降低，提示鋅預處理能影響NPP 模型動物脊髓鋅的分布。

本研究利用原子吸收光譜、金屬自顯影技術和圖像分析技術觀察了鋅預處理對辣椒素致痛模型小鼠脊髓后角淺層鋅離子分布的影響，結果發(fā)現(xiàn)足底注射辣椒素后，脊髓后角淺層的鋅離子顯著減少，提示鋅與NPP 的產(chǎn)生與傳導密切相關;此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)鋅預處理可以改變鋅離子在NPP 動物脊髓后角淺層的分布。本實驗有望為進一步研究鋅參與NPP 的形成機制提供基礎的實驗依據(jù)。

圖1 各組小鼠脊髓鋅的含量(mg/kg，，n=6)

圖2 金屬自顯影染色顯示鋅在各組模型動物脊髓的分布

圖3 各組小鼠脊髓的吸光度值(金屬自顯影染色圖像分析，，n=6)

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