Hedgehog 信號通路中Gli－1 蛋白在食管鱗癌中的表達及意義

鞠雷，甄偉，臧東鈺

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121001;2.盤錦市中心醫(yī)院，遼寧 盤錦 124000;3.遼東學院，遼寧 丹東 118000)

我國食管癌的發(fā)病率和死亡率高居世界首位［1］。盡管我國食管癌的診斷和治療水平處于世界領(lǐng)先地位，但綜合5 年生存率也在30% 左右，其根本原因還是無法做到早期診斷、早期治療。Hedgehog (Hh)信號傳導通路是一個經(jīng)典的胚胎發(fā)育信號通路［2］，近年研究發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤的發(fā)生、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用［3］。本實驗應用免疫組織化學技術(shù)，探討Hh 信號通路中核轉(zhuǎn)錄因子Gli－1 的異常激活與食管鱗癌間的關(guān)系，力爭為食管鱗癌的早期診斷和治療提供新的思路和線索。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 50 例食管鱗癌及癌旁組織標本取自遼寧醫(yī)學院附屬第三和第一醫(yī)院2010—2012年手術(shù)切除存檔蠟塊。患者均為男性，年齡49～75 歲，平均62 歲。Gli－1 兔多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，SABC 試劑盒購自武漢博士德生物制品有限公司。

1.2 免疫組織化學染色 所有石蠟切片脫蠟水化，抗原修復，3%H2O2孵育，滴加一抗(1 ∶50)，4℃濕盒過夜，滴加二抗，37 ℃溫箱20 min，滴加SABC 液，37 ℃溫箱30 min，DAB 顯色，蘇木素復染細胞核，脫水，透明，二甲苯封片。用已知的陽性對照片做陽性對照，PBS 代替一抗作陰性對照，光學顯微鏡下觀察并攝片。

1.3 結(jié)果判定 Gli－1 蛋白以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)淺黃色至深棕色顆粒判斷為陽性細胞。隨機選取10個高倍視野，分別計數(shù)200 個細胞。以染色強度結(jié)合陽性細胞百分比綜合計分進行定性分析。(1)計數(shù)陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比并分級，0～5%、5～25%、25～50%和＞50%分別對應0、1、2 和3 分;(2)根據(jù)陽性細胞的著色強弱分級，陰性、淺黃色、棕色和深棕色分別對應0、1、2 和3 分。兩項評分相加后進行判斷，0 分、1～2 分、3～4 分和5～6 分分別對應－ (陰性)、 + (弱陽性)、+ + (中度陽性)和+ + + (強陽性)。我們判定+ + / + + +為異常表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學結(jié)果 Gli－1 蛋白主要表達在胞質(zhì)或胞核，它在癌旁組織中表達較弱，但在鱗癌中表達明顯增強，二者比較有顯著性差異(圖1)。

2.2 Gli－1 在ESC 中的表達與臨床病例特征的關(guān)系 Gli－1 在ESC 及PC 中的表達與患者的年齡、病變部位無顯著相關(guān)(P ＞0.05)，但Gli－1 在ESC 中的表達與腫瘤分化程度、TNM 分期密切相關(guān)(表1)。

表1 50例患者Gli－1 蛋白在食管鱗癌及癌旁組織中的表達與臨床病例特征的關(guān)系

3 討 論

近年來發(fā)現(xiàn)，一些在胚胎發(fā)育、細胞分化過程中起重要調(diào)控作用的信號傳導通路 (如Wnt、Norch、TGF 及Hedghoge 等)，在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。Hh 信號傳導通路是一個經(jīng)典的胚胎發(fā)育信號通路，但在多種腫瘤組織中都存在Hh 信號通路的異常激活［4－6］，尤其是其上游配體Shh 和下游轉(zhuǎn)錄因子Gli－1 不同程度的激活，可以使得腫瘤細胞更具有侵襲性和轉(zhuǎn)移能力［7］。因此本實驗采用免疫組織化學技術(shù)并結(jié)合臨床資料，研究Hh 通路中Gli－1 蛋白在食管鱗癌中的表達及意義，以探討Hh 信號轉(zhuǎn)導通路的異常激活與食管鱗癌之間的關(guān)系。

Hh 信號通路主要由Hh 配體與膜蛋白受體Ptch 及Smo 組成復合物，其下游包含Gli、Fu、Su(Fu)等許多分子。當Hh 大量存在時，Ptch 可與Shh 結(jié)合并解除對Smo 的抑制作用，Smo 可與信號通路下游的因子SU、FU 及Gli 等結(jié)合，使Gli 活化并進入細胞核，進而調(diào)節(jié)多種靶基因的表達。Gli 家族在脊椎動物中包括Gli－1、Gli－2 和Gli－3 三種轉(zhuǎn)錄因子。Gli－1 主要起激活目的基因轉(zhuǎn)錄的作用，同時也是該信號通路下游的目的基因分子，腫瘤組織中Gli－1mRNA 表達上調(diào)是該信號通路異常活化的標志［8］。Kogerman 等［9］報道，阻止Gli－1 入核可以抑制目標基因的轉(zhuǎn)錄激活，表明Gli－1 入核對于Hh 信號通路運作非常重要。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Gli－1 蛋白主要表達在胞質(zhì)和胞核，它在癌旁食管組織中表達較低，但在癌組織中的表達明顯增強，而且隨著分化程度的降低和TNM 分期的升高，Gli－1 蛋白的表達逐漸增強。因此我們認為，在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在Hh 信號通路的異常激活。

許多參與腫瘤細胞增殖與擴散的效應分子均源于Hh 信號通路的靶基因或下游分子，且Hh 信號通路與其它調(diào)控腫瘤細胞分化、增殖的信號通路也有著交叉作用。因此，深入研究Hh 信號傳導通路與食管癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，對進一步提高食管癌的診斷和治療水平具有重要意義。

圖1 Gli－1 在食管鱗癌中的表達 ×400

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