Innexin 通道蛋白功能研究進展

李 明，楊 洋，張 艷，龐尊玉，羅開珺

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南省高校動物遺傳多樣性和進化重點實驗室，昆明 650091)

在多細胞生物中，相鄰細胞膜上的hemichannel 對接形成的GJ，是細胞之間的連接方式之一，屬于膜通道結(jié)構(gòu)，參與介導(dǎo)相鄰細胞間的信號傳遞。在脊椎動物中，構(gòu)成hemichannel 的是connexin(Cx)和pannexin(Px);在無脊椎動物中，形成hemichannel 的間隙連接蛋白被命名為innexin(Inx，為Px 蛋白的同源物)。目前大約有21種 connexins 基 因(Cruciani and Mikalsen，2007)、3種pannexins 基因(Panchin et al.，2000)和25種innexins 基因(Scemes et al.，2009)被克隆出來。這三類蛋白形成的hemichannel 有著相似的拓撲結(jié)構(gòu):一個hemichannel 由六個跨膜蛋白組成，一個蛋白由四個跨膜結(jié)構(gòu)域、兩個胞外環(huán)、一個胞內(nèi)環(huán)以及一個N 端和一個C 端構(gòu)成。其中connexin(Cx23 除外)的胞外環(huán)有6個保守的半胱氨酸殘基，innexin 的胞外環(huán)有4個保守的半胱氨酸殘基(見圖1)。這些相似的結(jié)構(gòu)提示它們在形成GJ 的過程中有類似的連接方式。最近研究顯示，Cx 蛋白組成的hemichannels 不僅僅是作為Gap junction 的亞單位，該蛋白還具有酶和轉(zhuǎn)運體的雙重功能，能獨立于 GJ 存在于胞膜上形成hemichannels，作為胞內(nèi)與胞外小分子的通路，參與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持細胞正常生理狀態(tài)(Vinken et al.，2006;Vinken et al.，2011)。無脊椎動物的innexins 研究不如哺乳動物的廣泛，近幾年，隨著昆蟲當(dāng)中innexins 蛋白被逐步克隆得到，對其功能的研究也逐漸展開。本文主要就Inx 蛋白自身及其形成的hemichannels 兩個方面的研究進展作一綜述。

圖1 Innexin 蛋白、半通道和縫隙連接分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Molecular architecture of innexin，hemichannel and gap junction

1 Inx 蛋白的研究

1.1 Inx 蛋白研究概述

Inx 基因在動物體內(nèi)的分布比較廣，與之相關(guān)的研究最先是從果蠅和家蠶中展開的。被命名為Orge 的蛋白是最初被研究的Inx 蛋白，像Shanking B、unc、eat 蛋白其實也是屬于Inx 蛋白家族，只是當(dāng)時由于并不清楚此類蛋白究竟歸于哪一類蛋白，且對其結(jié)構(gòu)域沒有統(tǒng)一的進行分析，所以蛋白名稱存在多樣化(Phelan et al.，1998)。之后，越來越多的類似基因在無脊椎動物當(dāng)中被克隆得到，并且隨著研究的深入，生物信息學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)此類蛋白與脊椎動物的Cx 蛋白相比，兩者有著相似的跨膜結(jié)構(gòu)和類似的功能，因而人們才將無脊椎動物當(dāng)中的這類蛋白稱之為 innexin(Phelan，2000;Phelan and Starich，2001;Yen and Saier，2007)。從此，Inx 蛋白成為了構(gòu)成GJ 的另一類通道蛋白。生物信息學(xué)的分析表明，昆蟲的Inx 蛋白在第二個跨膜區(qū)域前端具有特征序列YYQWV，并且是完全保守的(Hua et al.，2003)。越來越多的研究表明，Inx 蛋白具有多重功能，除了傳統(tǒng)上的參與構(gòu)建GJ 介導(dǎo)相鄰分子的信號傳導(dǎo)外，其本身的功能研究也越來越受到重視。

1.2 Inx 蛋白的表達分布及功能探討

對于Inx 蛋白的功能研究在果蠅的胚胎發(fā)育與形態(tài)發(fā)生上較為集中，其次是在線蟲、家蠶、蝗蟲等物種上。在果蠅中，Bohrmann和Zimmermann(2008)研究顯示，在果蠅卵子的發(fā)育過程中，Inx1 主要分布于卵泡細胞的底部兩側(cè)，Inx2 定位于頂部兩側(cè)，Inx3 在卵泡細胞和滋養(yǎng)細胞的兩側(cè)有觀察到，Inx4 在5 期的卵膜細胞和12 期的滋養(yǎng)細胞膜上有檢測到，而且Inx2和Inx3、Inx2 于Inx4 之間的表達分布還存在協(xié)同作用。Tazuke 等(2002)發(fā)現(xiàn)，果蠅早期正在分化的生殖細胞的存活需要inx4 基因的表達;Bauer 等(2004)的研究發(fā)現(xiàn)inx2 對胚胎上皮組織的形態(tài)發(fā)生是必須的;而ogre and shaking B 對果蠅目視系統(tǒng)的正常形成(Phelan，2005)、shakB 對感覺神經(jīng)元和突觸之間的電傳導(dǎo)的作用(Trimarchi and Murphey，1997)、inx2 控 制 果 蠅 胚 胎 前 腸 的 發(fā) 育(Bauer et al.，2002)等方面都發(fā)揮著重要作用。在線蟲中，目前已經(jīng)有25個inx 基因被克隆得到(Phelan and Starich，2001;Scemes et al.，2009)，當(dāng)這些基因發(fā)生突變時，會影響到線蟲的發(fā)育或某些組織器官的功能。如Chuang 等(2007)研究發(fā)現(xiàn)nsy-5在線蟲胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)左右極的不對稱分化的過程中有大量的表達。Starich 等(Starich et al.，1996;Phelan and Starich，2001)認為unc-7和unc-9 同時突變會導(dǎo)致線蟲運動缺陷，并改變線蟲對麻醉劑的敏感性和對驅(qū)蟲劑雙氫除蟲菌素的耐藥性;基因eat-5和inx6 在線蟲咽部表達，對肌肉的同步收縮是必不可少的(Starich et al.，1996;Li et al.，2003);而線蟲的胚胎發(fā)生需要inx3 基因的表達(Starich et al.，2003)。Ganfornina 等發(fā)現(xiàn)Inx1 蛋白主要對蝗蟲的胚胎神經(jīng)系統(tǒng)，特別是神經(jīng)的前期發(fā)育方面起著重 要 作 用(Ganfornina et al.，1999)。Hong 等(2008)的研究報告表明，家蠶中的inx2 基因在胚胎發(fā)育的整個過程都起作用，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中有高表達;而Inx4 蛋白主要在家蠶幼蟲和蛹期階段的睪丸和卵巢組織中含量豐富，提示inx4 基因?qū)倚Q生殖系統(tǒng)的發(fā)育有重要作用。

1.3 Inx 蛋白之間的相互作用

通道蛋白在形成通道的過程中或形成通道以后，更多的是受到其它信號分子或蛋白酶的調(diào)控。但近來有研究表明，Inx 蛋白之間還存在相互作用，而且這種相互作用對一些組織的發(fā)育或信號的傳遞起著重要的作用。Chen 等(2007)在研究GJ 對線蟲發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)控作用過程中發(fā)現(xiàn)，UNC-1 可能調(diào)節(jié)UNC-9 的功能或分布，UNC-9 蛋白在膜上可以形成同聚體半通道，相鄰的兩個細胞進而形成GJ，而UNC-9 通道的開關(guān)卻受到UNC-1 蛋白調(diào)控。當(dāng)UNC-1 蛋白存在時，可以跟UNC-9亞體結(jié)合，此時通道打開;當(dāng)UNC-1 不存在時，通道關(guān)閉(圖2)。但當(dāng)UNC-9 與GFP 以融合蛋白的形式表達時，形成的通道將一直保持開放狀態(tài)(組成型開放通道)，這可能是由于GFP 蛋白的存在對UNC-9亞體之間的結(jié)合產(chǎn)生了位阻現(xiàn)象，起到了UNC-1 蛋白的類似作用。Lehmann 等人(2006)的研究表明，Inx2蛋白和Inx3 蛋白在膜上的分布和定位是相互影響的，這一點也得到了Bohrmann和Zimmermann 兩人的證實(2008)。當(dāng)沉默inx2 基因的表達時，Inx3 蛋白會在細胞中積累并分布紊亂，反之亦然。inx2和inx3 基因協(xié)同表達后通過細胞內(nèi)的C 端功能域相互作用形成異聚化的Inx2:Inx3 通道，這對果蠅胚胎的上皮組織發(fā)育和胚胎表皮極性的形成起著關(guān)鍵作用。如果inx2 或inx3 發(fā)生突變，會導(dǎo)致表皮上有大的皮孔形成，極端情況下甚至導(dǎo)致外皮的缺失。該研究組通過配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)篩選出 anti-innexin2的適配體(aptamer)，該適配體可以抑制Inx2和Inx3 在C 端功能域的相互作用，進一步證實了Inx2和Inx3 之間相互作用的機制(Knieps et al.，2007)。

2 Inx－h(huán)emichannel 的研究

2.1 Inx－h(huán)emichannel 介導(dǎo)信號分子的釋放

Inx-hemichannel 具有雙重功能，除了兩個相鄰的hemichannel 對接形成GJ 外，其本身也可以形成功能性的non-junctional 膜通道，這些膜通道可以介導(dǎo)釋放各種小分子物質(zhì)(Bao et al.，2007)。ATP 是細胞內(nèi)最重要的能量分子，也是參與細胞間信息傳遞的重要信號分子，在外界環(huán)境或內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化的情況下如低氧、離子濃度改變、pH等因素的刺激下細胞釋放ATP 增加。既往研究提示Cx 或Px 蛋白組成的GJ/hemichannel 可能參與ATP 的 釋 放(Bao et al.，2004;Vessey et al.，2005;Thompson et al.，2006;Iglesias et al.，2009)。Bao 等(2007)的研究顯示在爪蟾卵母細胞中表達Inx 蛋白形成的hemichannel 傳導(dǎo)功能類似于Px-hemichannel，而與Cx-通道有所不同。inx2、inx3 或inx6 表達后，可以記錄到約500pS 的通道電流(Px1 在爪蟾卵母細胞中表達記錄到的通道電流為550pS 或475pS)。當(dāng)細胞發(fā)生高鉀去極化時通道開放，ATP 釋放增加;而pH 下降如暴露在CO2時則起到抑制作用。與Px-hemichannel 一樣，ATP 的釋放也都能被GJ 通道阻斷劑生胃酮(carbenoxolone，CBX)阻斷，提示ATP 的釋放可能由Inx-hemichannel 介導(dǎo)。Luo和Turnbull 利用熒光染料吸收的方法首次在昆蟲細胞中證實了存在有功能性的Inx-hemichannel 通道，結(jié)果顯示不同的條件下通道的活性會發(fā)生改變(Luo and Turnbull，2011)，與Bao 等人在螞蟥中的研究結(jié)果一致(Bao et al.，2007)。研究中還發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS，來自于革蘭氏陰性菌)會抑制昆蟲細胞Inx-半通道的活性，而這種物質(zhì)對哺乳動物白細胞Cx-hemichannel 的活性有著復(fù)雜的影響(De Maio et al.，2000;Oviedo-Orta et al.，2000;Temme et al.，2000)。這提示Inx-hemichannel 介導(dǎo)的信號分子釋放可能參與了免疫反應(yīng)的信號傳導(dǎo)，這在Samuels 等的研究中得到了進一步的證實，結(jié)果顯示在螞蟥神經(jīng)系統(tǒng)中通過Inx-通道釋放的ATP 控制著小膠質(zhì)細胞(一種神經(jīng)免疫細胞)向神經(jīng)受損處的遷移(Samuels et al.，2010)。

鈣波也是細胞通訊的一個重要方式，參與多種生理活動過程。Px-通道參與鈣波的傳遞得到了越來越多研究結(jié)果的證實(Thompson et al.，2006;Vanden et al.，2006;Peters et al.，2007)。Px-通道不但存在于細胞膜上，也可能存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上(細胞內(nèi)通道)，在受到缺血等刺激的情況下，不但釋放ATP，還可能釋放鈣離子和一氧化氮等信號分子。與Px 蛋白類似，同源的Inx-通道也極可能參與了鈣波和其他信號分子的傳遞。Bouhours 等(2011)的研究提示，作為Inx 蛋白家族成員之一的UNC-7 蛋白構(gòu)成的細胞膜通道或細胞內(nèi)通道在特定的生理條件下可能影響著細胞內(nèi)ATP、鈣離子或其它離子濃度的變化，進而對其他的生理功能產(chǎn)生影響。

2.2 Inx－h(huán)emichannel 與細胞凋亡

Elliott 等(2009)發(fā)現(xiàn)ATP 或UTP 可以作為開始凋亡的細胞釋放的一種信號，以吸引巨噬細胞，但這個信號通過何種途徑釋放到細胞外，當(dāng)時并不是很清楚。隨后，Chekeni 等(2010)通過CBX 阻斷和RNA 干擾實驗結(jié)合膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)ATP 或UTP 是通過Px1-通道釋放的。當(dāng)通過ATP或UTP 信號途徑激活凋亡蛋白半胱天冬酶3(caspase3)時，激活的caspase3反過來作用Px1蛋白的C-末端，使得Px1 通道組成型開放，最終導(dǎo)致細胞凋亡。作為Px 蛋白的同源物，Inx 蛋白在無脊椎動物細胞是否介導(dǎo)了細胞的凋亡，目前還未見報道。作為一類功能保守的蛋白，根據(jù)Px1-hemichannel 介導(dǎo)了細胞凋亡已獲得證實的報道，我們可以合理推測Inx-hemichannel 也參與了細胞凋亡的信號通路。Luo 等人的最新研究表明，在家蠶細胞Bm12 中過量表達inx2和inx3 基因，細胞出現(xiàn)聚集和粘附現(xiàn)象，這與昆蟲細胞在受到外源刺激或侵入時出現(xiàn)的集結(jié)和包囊作用相符合;在草地灘夜蛾Sf9 細胞中過量表達inx2和inx3 基因，細胞表現(xiàn)出凋亡特征(出現(xiàn)凋亡小體)，而昆蟲免疫細胞正是通過集結(jié)和包囊后的細胞凋亡來清除外源病毒等侵入物(待發(fā)表資料)。所以，從這一點來看，Inx-hemichannel 也參與介導(dǎo)了細胞免疫反應(yīng)。

2.3 Inx－h(huán)emichannel 開放的調(diào)控

在正常的生理狀態(tài)下，細胞膜上的hemichannel 大多處于關(guān)閉狀態(tài)，以保持細胞內(nèi)容物和細胞體積的相對穩(wěn)定。Px1-hemichannel 一方面可以通過釋放ATP 作用于相鄰細胞P2Y 受體產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)，IP3 誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+使細胞內(nèi)Ca2+濃度增高;另一方面，ATP 也可以通過激活P2X7 受體使細胞內(nèi)Ca2+濃度增高，P2X7 受體的激活或細胞內(nèi)Ca2+濃度增高都可以誘導(dǎo)Px1-hemichannel的 開 放(Locovei et al.，2006;Pelegrin and Surprenant，2006;Locovei et al.，2007)。而Cx-hemichannel 在細胞外Ca2+濃度下降時通道開放增加，Ca2+濃度升高時通道開放減少(Li et al.，1996;Zhang et al.，2006;Verselis and Srinivas.2008)，pH 下降時減少通道開放(Trexler et al.，1999)。在Inx-hemichannel 中，當(dāng)升高細胞外液Ca2+濃度或Mg2+濃度時，Inx-hemichannel 的開放增加;當(dāng)LPS 免疫刺激時，Inx-hemichannel 開放減少(Bao et al.，2007;Luo and Turnbull，2011)。這些研究結(jié)果顯示hemichannel 的開放與陽離子濃度特別是Ca2+濃度的變化相關(guān)，而Ca2+濃度的變化與calmodulin(鈣調(diào)蛋白)的活性密切相關(guān)。當(dāng)細胞內(nèi)Ca2+濃度升高時可以激活calmodulin，calmodulin 再與通道蛋白相互作用調(diào)控通道的開關(guān)(zhang et al.，2006;Decrock et al.，2011)。在線蟲細胞中，Inx-hemichannel 的開放和關(guān)閉還與Inx 蛋白之間的相互作用有關(guān)，當(dāng)UNC-1 與UNC-9 結(jié)合時，通道開放，分開時通道關(guān)閉(圖2)。根據(jù)Px1 蛋白的研究結(jié)果(Chekeni et al.，2010)，我們也可以推測，Inx 蛋白組成的hemichannel 也可能是Caspase 蛋白酶的作用靶標(biāo)，當(dāng)其被激活的Caspase 剪切后，會造成Inx-hemichannel 的永久性開放。

圖2 UNC-1 與UNC-9 相互作用模式圖(Chen et al.，2007)Fig.2 The interaction of UNC-1 and UNC-9(Chen et al，2007)

3 展望

集合了Cx 蛋白和Px 蛋白兩類蛋白功能的Inx蛋白，其被研究的程度還不如前兩者，但也受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。目前研究顯示Inx 蛋白具有多重功能，主要體現(xiàn)在Inx 蛋白本身、Inx-hemichannel和Inx-GJ 三個方面。Inx-GJ 在胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、器官形成、生理活動的協(xié)調(diào)、信號傳遞等方面的功能基本得到了共識(Vinken et al.，2011)。而作為Px蛋白同源物的Inx-hemichannel 的功能，目前雖然研究成果不是很多，其功能活動的存在還是得到了部分的證實，但還有諸多問題有待闡明，比如Inx 通道的開放除了允許ATP、Ca2+等小分子的通過外，還可以介導(dǎo)哪些信號分子的釋放;數(shù)量超過25種的Inx 蛋白是根據(jù)什么方式來組成同源型或異源型通道的，其之間的相互作用是怎樣的?hemichannel 在細胞內(nèi)部的分布情況和功能活動又是如何的?在病理情況下該通道的組裝和開放情況如何等都值得深入探討。Inx 蛋白本身的功能目前爭議還比較大，主要的爭論點在于利用目前的研究手段，比如敲除或沉默相關(guān)基因表達時，其表現(xiàn)出來的功能缺陷是由于蛋白本身引起的，還是由于在缺少該蛋白時不能正常組裝hemichannel 或GJ 時引起的。但隨著研究手段的改進和完善以及研究的深入，Inx 蛋白及其組成的hemichannel 的更多功能將被闡釋，Inx 蛋白可能成為昆蟲病蟲害防治的干預(yù)靶點。

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