氫氣生理鹽水對大鼠肝缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

駱助林，湯禮軍，汪 濤，羅 浩，黃 竹，王 華，田伏洲

肝臟的缺血再灌注損傷(ischemia－reperfusion injury，IRI)是肝臟外科重要的臨床病理生理過程，導(dǎo)致肝葉切除、肝移植術(shù)后器官功能障礙和衰竭的重要因素［1］。因此在肝臟外科中如何采取措施，減輕肝臟缺血再灌注損傷具有重要意義。最近發(fā)現(xiàn)氫氣能抑制炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子、緩解炎癥發(fā)展，抑制氧化應(yīng)激損傷，具有潛在的治療炎癥應(yīng)激性疾病的作用［2］，我們推測氫氣生理鹽水(hydrogen-rich saline，HS)在肝臟缺血再灌注損傷過程中氧化應(yīng)激損傷中也起著一定的作用，因此我們采用70%大鼠肝臟缺血再灌注模型，對氫氣生理鹽水在肝臟缺血再灌注損傷中的作用進(jìn)行研究，報告如下。

材料與方法

1 實驗動物分組及處理

成年健康雄性清潔級Wistar大鼠32只，質(zhì)量(200±50)g，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心提供［動物合格證編號:SCXK(渝)20020002］。氫氣生理鹽水(0.6mM)由第二軍醫(yī)大學(xué)孫學(xué)軍教授提供［3］，儲存于密封的塑膠袋中 4°C 下保存，使用前經(jīng)伽瑪射線消毒。將32只大鼠均分成4組(n=8):(1)假手術(shù)組(sham)，動物只接受開腹關(guān)腹手術(shù);(2)肝缺血再灌注組(IR);(3)肝缺血再灌注+生理鹽水處理組(IR+NS);(4)肝缺血再灌注+氫氣生理鹽水處理組(IR+HS)。

2 動物模型制作

大鼠術(shù)前禁食12h，自由飲水，乙醚吸入麻醉。腹正中切口約2cm，用小血管夾夾閉左、中葉肝蒂，造成70%肝臟缺血動物模型［4］，保持肝右葉和尾狀葉血流通暢，45min后取下血管夾恢復(fù)肝臟血供后關(guān)腹。氫氣生理鹽水(0.6mM，6ml/kg，pH 7.4)或者生理鹽水(6ml/kg)在肝臟缺血同時經(jīng)尾靜脈注射。假手術(shù)組僅開腹后游離肝臟周圍韌帶然后關(guān)腹。術(shù)后大鼠自然清醒并自由飲水。

3 檢測指標(biāo)及方法

術(shù)后12h處死大鼠，統(tǒng)一取大鼠部分組織肝，用10%甲醛固定并常規(guī)制作石蠟病理切片，蘇木精-伊紅染色(HE)后由專門的病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行病理觀察，剩下的肝組織0°C生理鹽水中冰浴保存。大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AIR)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平采用全自動生化分析儀檢測，肝組織內(nèi)SOD活性、GSH、MDA含量均采用檢測試劑盒(南京建成生物制品公司)并按說明書進(jìn)行操作。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)，GSH含量測定采用化學(xué)比色法，MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸(TBA)法。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 肝組織病理學(xué)變化

鉗夾肝蒂后，肉眼觀察到被阻斷的肝葉明顯缺血發(fā)暗，肝臟表面可見淤積斑塊，開放后可見充血紅潤。各組肝組織病理變化見附圖。假手術(shù)組大鼠各時點肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎癥細(xì)胞，肝細(xì)胞無變性壞死(圖1a)。IR組和IR+NS組大鼠術(shù)后12h可見肝竇內(nèi)瘀血及部分肝細(xì)胞變性壞死，匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞聚集，以中性粒細(xì)胞為主，肝臟組織結(jié)構(gòu)疏松，部分組織結(jié)構(gòu)不完整(圖1b、C);IR+HS組大鼠術(shù)后12h細(xì)胞腫脹變性，點狀肝細(xì)胞壞死，肝臟組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主，肝臟組織結(jié)構(gòu)基本完整(圖1d)。

圖1 各組術(shù)后12h肝臟組織病理變化(HE ×400)

2 術(shù)后12h血清ALT、AST的檢測

IR組、IR+NS組與IR+HS組動物于造模術(shù)后12h血清ALT、AST明顯升高;與IR+NS組相比較，IR+HS組術(shù)后12h血清 ALT、AST升高較少(P ＜0.05)(表 1)。

表1 術(shù)后12h血清ALT、AST(IU/L，±s，n=8)

表1 術(shù)后12h血清ALT、AST(IU/L，±s，n=8)

與 IR+NS組相比較:△P ＜0.05

分組ALT AST sham 29.88 ±4.85 94.38 ±14.27 IR 264.13 ±24.29 427.38 ±16.81 IR+NS 227.63 ±1.41 420.54 ±35.18 IR+HS 108.13 ±28.06△ 265.55 ±27.68△

3 術(shù)后12h肝組織內(nèi) SOD活性和GSH、MDA含量的檢測

IR組、IR+NS組與IR+HS組動物于造模術(shù)后12h肝組織內(nèi)MDA含量明顯升高，SOD活性和GSH含量下降;與IR+NS組相比較，IR+HS組術(shù)后肝組織內(nèi)MDA含量升高較少(P＜0.05)，SOD活性和GSH含量下降程度也較低(P＜0.05)(表2)。

表2 術(shù)后12h肝組織內(nèi)SOD活性和GSH、MDA含量的檢測(±s，n=8)

表2 術(shù)后12h肝組織內(nèi)SOD活性和GSH、MDA含量的檢測(±s，n=8)

與 IR+NS組相比較:△P ＜0.05

分組 SOD(U/mg)MDA(pmol/mg)GSH(pmol/mg)sham 38.2 ±4.9 23.5 ±7.1 2675 ±157 IR 12.9 ±2.2 87.4 ±13.6 1234 ±113 IR+NS 12.4 ±3.6 86.7 ±26.8 1287 ±175 IR+HS 21.6 ±2.5△ 38.4 ±11.5△ 1971±96△

討 論

肝臟IRI的確切機(jī)制目前仍不清楚，氧自由基的大量形成和脂質(zhì)過氧化的增加是細(xì)胞損傷的主要病理過程之一，氧化應(yīng)激損傷在局部及全身炎性損傷中起重要作用［5］。器官、組織IRI時發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，大量的炎癥細(xì)胞活化并分泌大量的炎癥遞質(zhì)，引起局部及全身的器官損傷［6－7］。再灌注早期中性粒細(xì)胞即開始向損傷部位浸潤，通過釋放ROS以及多種蛋白水解酶(蛋白酶、彈性蛋白酶以及MPO 等)加重細(xì)胞損傷［8－9］。Glantzounis等［10］發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)在肝臟氫氣生理鹽水中起非常重要的作用。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時，ROS的產(chǎn)生與清除之間的平衡將會被打破，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)的衰竭或者氧化物大量產(chǎn)生。對于肝臟缺血再灌注進(jìn)行某些處理，如缺血預(yù)處理、熱應(yīng)激預(yù)處理、藥物處理等，可以降低中性粒細(xì)胞的浸潤，提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性，阻止 ROS，減輕肝臟損傷程度［11］。

氫氣是質(zhì)量最輕的小分子氣體，很容易擴(kuò)散并輕易地穿過細(xì)胞膜。最近Ohsawa等［2］研究發(fā)現(xiàn)氫氣的抗氧化特性，在臨床治療氧化應(yīng)激損傷方面有廣闊的應(yīng)用前景，為氫氣的臨床應(yīng)用提供了方向。將氫氣溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基中，則能防止細(xì)胞在氧化損傷后出現(xiàn)的線粒體去極化、AIR缺乏、DNA氧化、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和細(xì)胞的壞死、凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞活力。因此我們推測HS處理后，在缺血再灌注過程中也能緩解氧化應(yīng)激損傷，減輕肝缺血再灌注時的局部和全身損害。

本研究采用70%大鼠肝臟缺血再灌注模型，術(shù)中經(jīng)HS經(jīng)尾靜脈注射，術(shù)后通過病理評分顯示與IR+NS組相比較，IR+HS組病理損傷明顯較輕，說明HS處理能明確減輕IR病理損傷。我們觀察到再灌注后12h，肝臟組織內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤，而HS明顯降低了肝臟組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤。SOD和GSH對機(jī)體的氧化與抗氧化的平衡起著關(guān)鍵作用，能加速清體內(nèi)除自由基和過氧化物，降低脂質(zhì)過氧化物的生成，自由基和過氧化物對細(xì)胞和組織的損傷。MDA是細(xì)胞膜的重要成分－非飽和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，組織內(nèi)MDA含量是體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)水平及程度的敏感指標(biāo)［12］。與IR+NS組相比較，IR+HS組術(shù)后肝組織內(nèi)MDA含量升高較少(P＜0.05)，SOD活性和GSH含量下降程度也較低(P＜0.05)，提示HS處理后的IR大鼠明顯的改善了氧化應(yīng)激的損傷。本研究證實，HS能夠通過抑制肝缺血再灌注后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕肝IRI，但其具體過程和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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