眼部不同方式注射川芎嗪抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的比較研究

易細(xì)香，徐 敏，傅 培

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院眼科，廣東 深圳518036）

視網(wǎng)膜新生血管形成，是糖尿病視網(wǎng)膜病變、眼底血管栓塞、缺血性眼病等最終導(dǎo)致視力喪失的重要原因，迄今尚無有效的治療方法。川芎嗪在改善血液流變學(xué)異常、改善微循環(huán)方面有一定優(yōu)勢。穴位注射是傳統(tǒng)的針灸療法與現(xiàn)代的注射、封閉方法相結(jié)合的有效而無副作用的治療方法。本文從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方面探討川芎嗪對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成的干預(yù)作用，并探討安全有效、無創(chuàng)的局部給藥途徑，為治療血管源性眼病開辟新的給藥途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 出生后第7天的健康C57BL／6J幼鼠90只，雌雄不限，未斷奶與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，廣州動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0097634。

1.1.2 儀器 電腦氧氣濃度控制儀(產(chǎn)地青島，型號(hào)MBKY-2F)、光學(xué)顯微鏡（德國Leica DM4000B）。

1.1.3 試藥 鹽酸川芎嗪注射液(20 mg／mL)，常州制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：001002。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 參考Smith等[1]和張正培等[2]的方法建立氧誘導(dǎo)的血管增生性視網(wǎng)膜病變幼鼠模型，取健康幼鼠C57BL/6J 90只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組（A組）、太陽穴穴位注射組（B組）、睛明穴穴位注射組（C組）、玻璃體腔注射組（D組）、鼠尾靜脈注射組（E組），每組15只，與哺乳母鼠一起置于干燥密閉玻璃容器內(nèi)，提供足夠的食物及水。除正常組外，其他組予以持續(xù)高氧混合氣體(75%氧氣和25%氮?dú)?，在此高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d后將幼鼠取出，回到正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)養(yǎng)，建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管病變幼鼠模型。

1.2.2 給藥方法 根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸圖譜取穴，B組、C組分別取小鼠太陽穴、睛明穴，針1～3 mm，推藥前捻轉(zhuǎn)刺激后用裝有川芎嗪注射液的微量注射器，推藥0.02 mL，(含川芎嗪0.4 mg)，每日1次，連續(xù)7 d；D組玻璃體腔注射川芎嗪注射液0.01 mL(含川芎嗪0.2 mg)，E組鼠尾靜脈注射川芎嗪0.02 mL(含川芎嗪0.4 mg)，每日1次，連續(xù)給藥7 d；正常組與模型對(duì)照組每天鼠尾靜脈注射等容積生理鹽水0.02 mL，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 視網(wǎng)膜新生血管細(xì)胞核計(jì)數(shù) 治療結(jié)束5 d后所有小鼠頸椎脫臼處死，取出右眼，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水、透明、浸蠟、切片。采用厚度為6μm的連續(xù)切片，切片方向平行于角膜至視盤的矢狀位平面。常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。每只眼球間斷取10個(gè)病理不含視乳頭切片，相鄰兩個(gè)切片間隔60μm(10個(gè)切片)，計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目，統(tǒng)計(jì)平均每只眼球每張切片突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。

1.2.4 動(dòng)物血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）含量測定 小鼠處死后眼球采血。采用雙抗體夾心法測定血清血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子含量，操作方法按說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

1.1 視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)

正常對(duì)照組15眼有5眼見極少數(shù)突破內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜血管芽，其細(xì)胞核數(shù)為1～10個(gè)，其余10眼均未見視網(wǎng)膜新生血管芽；其余組均可見視網(wǎng)膜新生血管芽，發(fā)生率為100%。A組（130.83±41.63）個(gè)與正常對(duì)照組（6.56±3.41）比較（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模成功。B、C、D、E組均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；B組分別與D組、E組比較，D組與E組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C組分別與B組、D組、E組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜新生血管芽細(xì)胞核數(shù) （±s，n=15）

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜新生血管芽細(xì)胞核數(shù) （±s，n=15）

注：與模型對(duì)照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與睛明穴注射組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別 給藥劑量(mg/只)血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目（個(gè)）血清VEGF含量(mg/L正常對(duì)照組 — 6.56±3.41# 9.28±1.26#A組 — 130.83±41.63** 18.31±4.33**B組 0.40 68.39±32.07*# 13.35±2.41*##C組 0.04 75.23±27.12# 15.25±3.37##D組 0.02 58.56±36.21*# 12.32±2.53*#E組 0.04 59.39±21.78*# 12.37±3.11*##)

2.2 各組血清VEGF含量

B、C、D、E組均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），說明川芎嗪能有效抑制氧誘導(dǎo)小鼠VEGF形成；B組分別與D組、E組比較，D組與E組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C組分別與B組、D組、E組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

3 討論

大量研究表明，缺氧是導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成的主要刺激因素，將生后1周內(nèi)C57BL／6J幼鼠置于75%濃度的氧環(huán)境中連續(xù)生活5 d，回到正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)，即可見大量的視網(wǎng)膜新生血管形成[1]，先是高氧階段的血管閉塞和消失，正常發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管停止生長，然后是進(jìn)入空氣相對(duì)低氧的環(huán)境下，導(dǎo)致了在缺氧狀態(tài)下的視網(wǎng)膜血管異常增殖。缺氧可促進(jìn)VEGF的合成[3]，受缺氧調(diào)節(jié)的特性使其成為最重要的促新生血管形成因子，參與缺氧誘導(dǎo)有關(guān)的眼內(nèi)新生血管形成[4]。本文通過視網(wǎng)膜新生血管芽細(xì)胞核計(jì)數(shù)來判斷視網(wǎng)膜新生血管的增殖程度，新生血管芽細(xì)胞核數(shù)越多表明視網(wǎng)膜新生血管增殖越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模成功。

中藥川芎含有川芎嗪、阿魏酸鈉、川芎內(nèi)酯等化學(xué)成分，川芎嗪是其主要有效活性成分。川芎嗪有較強(qiáng)的擴(kuò)張微血管、改善微循環(huán)、降低血黏度、改善血液流變、降低毛細(xì)血管通透性、調(diào)節(jié)血小板功能和抗凝作用。川芎嗪對(duì)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生VEGF具有抑制作用[5]；可通過抑制DNA合成來抑制成纖維細(xì)胞的增殖[6]；倪峰[7]研究說明經(jīng)絡(luò)穴位對(duì)藥物有快速吸收和放大的效應(yīng)。穴位注射藥效具有高效性與速效性；具有穴效藥效“迭加效應(yīng)”，能減少用藥量，提高療效，是一種簡易而又有效的眼局部治療方法。睛明穴與太陽穴位于眼周，為眼部穴位注射常用穴位。玻璃體腔注藥抗VEGF治療近年臨床應(yīng)用較多，但玻璃體腔注藥為有創(chuàng)操作，術(shù)后并發(fā)癥較多。蔡?hào)|梅通過雙側(cè)針刺糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠睛明、太陽等穴，電鏡觀察大鼠微血管病變得到顯著改善[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用川芎嗪后，各注射組與靜脈注藥組小鼠血清VEGF含量明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），而且治療組視網(wǎng)膜新生血管細(xì)胞核數(shù)目較模型組明顯減少，組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），這一結(jié)果表明川芎嗪能有效抑制視網(wǎng)膜新生血管細(xì)胞形成、具有抗血清VEGF作用，說明川芎嗪對(duì)視網(wǎng)膜新生血管增殖具有抑制作用；川芎嗪太陽穴注射組與玻璃體腔注射組、靜脈給藥組間比較，小鼠血清VEGF含量、小鼠視網(wǎng)膜新生血管芽數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明川芎嗪太陽穴穴位注射與玻璃體腔注射、靜脈給藥療效相當(dāng)；睛明穴穴位注射組與玻璃體腔注射組、靜脈給藥組間比較，小鼠血清VEGF含量、小鼠視網(wǎng)膜新生血管芽數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明川芎嗪睛明穴穴位注射療效不如玻璃體腔注射、靜脈給藥途徑；川芎嗪太陽穴注射組與睛明穴穴位注射組療效比較，睛明穴穴位注射組小鼠視網(wǎng)膜新生血管細(xì)胞形成數(shù)目與血清VEGF均高于太陽穴注射組（P＜0.05），說明睛明穴穴位注射組療效不如太陽穴注射，太陽穴注射療效更佳。

太陽穴位于顳淺動(dòng)脈旁，顳淺動(dòng)脈旁注射復(fù)方樟柳堿治療缺血性眼底病在臨床廣泛應(yīng)用[9-10]，其機(jī)制是通過顳淺動(dòng)脈旁的自主神經(jīng)末梢使脈絡(luò)膜血管活性物質(zhì)維持正常水平，增加眼血流量，有助于解除脈絡(luò)膜血管痙攣，恢復(fù)脈絡(luò)膜血管正常舒縮功能促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，減輕脈絡(luò)膜缺血所導(dǎo)致的視神經(jīng)、視網(wǎng)膜缺血的病理改變，由于其簡單易行而被廣泛采用。

視網(wǎng)膜新生血管增殖的中藥治療目前尚處于初期研究階段，川芎嗪給藥新方式如球周穴位注射、玻璃體腔注射，新劑型的開發(fā)如膏藥穴位敷貼等，均具有很好的研究和應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)玻璃體腔注射微量川芎嗪，無一例發(fā)生眼內(nèi)炎，但璃體腔注射為有創(chuàng)操作，其安全性需進(jìn)一步研究，川芎嗪太陽穴穴位注射療效同玻璃體腔注射，安全，療效確切，為局部無創(chuàng)治療的最佳選擇，本實(shí)驗(yàn)為治療血管源性眼病開辟新的安全有效、簡便實(shí)用給藥途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Smith Lois EH，W esolowski E，Mciellan A，et a1.Oxygeninduced retinopathy in the mouse[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(1)：101-111.

[2]張正培，陳欽元，管孝群，等.重組血管生成抑制因子k4k5抑制視網(wǎng)膜新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華眼底病雜志，2003，19(2)：121-124.

[3]Nomura M，Yamagishi S，Harada S，et al.Possible Participationof autocrine and paracrine vascular en dothelial growthfactors in hypoxia-induced proliferation of endothelial cellsand pericytes[J].J Biol Chem，1995，270(47)：28 316-28 324.

[4]周洪偉，關(guān) 強(qiáng).血管內(nèi)皮生長因子及其受體與眼底新生血管[J].國際眼科雜志，2007，7(3)：791-795.

[5]陳忠平，姜德詠.川芎嗪對(duì)糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(16)：1 945-1 949.

[6]陳學(xué)忠.川芎嗪、丹參對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1987，7(9)：541-543.

[7]倪 峰，林靜瑜，周春權(quán)，等.穴位注射療法作用機(jī)制探討[J].中國針灸，2003，23(10)：609-611.

[8]蔡?hào)|梅，張秀萍，郝琳娜，等.針刺對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國針灸，2002，22(3)：186-188.

[9]宋 琛.缺血性眼病治療新概念[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：84，90，97.

[10]張金生.復(fù)方樟柳堿治療糖尿病視網(wǎng)膜血管病的臨床觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(4)：502-503.