不同炮制方法對水蛭中氨基酸及抗凝血酶活性的影響

王雨林，王實強，劉玉琴，2，謝 誼

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙410013；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208）

水蛭是傳統(tǒng)的破血逐瘀藥，始載于《神農本草經》，2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載供藥用的為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全體[1]。水蛭的主流商品為螞蟥和柳葉螞蟥，為了防止其入腹生子、降低毒性、矯嗅矯味等，多以炮制入藥[2]，本文通過對水蛭不同炮制品的氨基酸及抗凝血酶活性進行測定，為水蛭的傳統(tǒng)炮制工藝提供科學的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 儀器

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外可見檢測器，N2000數據工作站；真空干燥箱DZF-6050(上海精宏實驗設備有限公司)；AE240型分析天平(METTLER公司)；TGH-16C離心機（上海安亭科學儀器廠）；PHS-3C型精密pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

湖南產水蛭3批（長沙高橋藥材大市場），經湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所生藥室謝昭明研究員鑒定，1批為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra Whitman的干燥全體；2、3批為柳葉螞蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全體。牛纖維蛋白原(100 mg)、牛凝血酶(1 000 U)（Sigma公司）；對照品：L-谷 氨 酸 （140690-200401）、L-羥 脯 氨 酸（111578-200201）、甘氨酸（110735-200102）、L-丙氨酸（140680-200401）（均為中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用)；其他11種氨基酸對照品為均生化試劑：L-天冬氨酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）；L-組氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸（國藥集團化學試劑有限公司）；L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸（天津市光復精細化工研究所）；乙腈為色譜純；異硫氰酸苯酯、三羥甲基氨基甲烷及其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 水蛭的炮制[3]

2.1.1 生水蛭 揀凈雜質，用水洗凈，切成3～5分長節(jié)段、干燥、粉碎，過40目篩。

2.1.2 滑石粉炒法 將滑石粉置鍋內加熱炒至靈活狀態(tài)，投入水蛭段200 g，不斷翻動，使其鼓起，篩去滑石粉水蛭放涼后，粉碎，過40目篩。

2.1.3 砂炒水蛭 取細砂置于鍋內加熱均勻，再加入凈水蛭200 g，用文火炒至鼓起，酥脆，篩去細砂，水蛭放涼后，粉碎，過40目篩。

2.1.4 酒炙水蛭 取凈水蛭200 g，加酒20 mL，拌勻，悶透，置鍋內，用文火炒干，取出放涼，粉碎，過40目篩。

2.1.5 醋炙水蛭 取凈水蛭200 g，加醋30 mL，拌勻，悶透，置鍋內，用文火炒干，取出，放涼，粉碎，過40目篩。

2.1.6 蜜麩炒制法 取凈水蛭200 g，加酒20 mL，噴勻，悶潤1 h，另將蜜制麥麩置鍋內炒至略起煙，即投入水蛭共炒，不斷翻動，拌炒至水蛭表面棕黃色時取出，迅速倒入容器內，上蓋麻袋燜5～10 min，篩去麥麩，攤涼。

2.2 柱前衍生HPLC法測定水蛭不同炮制品中氨基酸的含量[4]

2.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Hypersil ODS2 C18色 譜 柱 （4.6 mm×200 mm，5μm）；流動相：以乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉溶液（3∶97）為流動相A（用冰醋酸調節(jié)pH值至6.5），以乙腈-水（4∶1）為流動相B，按表1進行梯度洗脫。檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：5μL。理論塔板數：按甘氨酸峰計算應不低于4 000。

表1 流動相洗脫梯度

2.2.2 供試品溶液的制備 （1）完全酸水解氨基酸樣品制備 取水蛭粉末0.1 g精密稱于安瓿瓶中，加6 mol/L鹽酸5 mL，置酒精噴燈上拉絲封口，超聲30 min使其溶解，置入烤箱中，150℃水解1 h。放冷，移入蒸發(fā)皿中，用10 mL水分次洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿，水浴蒸干。殘渣加0.1 mol/L鹽酸溶解，轉移至100 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）游離氨基酸樣品制備 取水蛭粉末1.0 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸適量，超聲處理（250 W，50 Hz）30 min，冷卻放至室溫，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，離心（3 000 r/min）10 min，取上清液，濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 混合氨基酸對照品溶液的制備 分別精密稱取天門冬氨基酸等14種氨基酸對照品適量，加0.1 mol/L鹽酸制成每1 mL分別含天門冬氨基酸0.097 2 mg、谷氨酸0.135 2 mg、羥脯氨酸0.043 6 mg、絲氨酸0.044 8 mg、甘氨酸0.073 2 mg、蘇氨酸0.033 6 mg、丙氨酸0.054 mg、酪氨酸0.024 mg、纈氨酸0.029 6 mg、甲硫氨酸0.022 mg、異亮氨酸0.023 6 mg、亮氨酸0.069 6 mg、苯丙氨酸0.023 6 mg、賴氨酸0.103 2 mg的混合對照品溶液。

2.2.4 衍生化 取對照品溶液和供試品溶液各2 mL，分別置10 mL離心管中，加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液1.0 mL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液1.0 mL，漩渦混合1 min，室溫放置1 h后，加入4 mL正已烷，漩渦混合1 min后，放置10 min，取下層溶液，濾過，即得。

2.2.5 測定法 分別吸取各衍生化溶液5μL，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，計算氨基酸含量即得。結果見表2，高效液相色譜圖見圖1。

2.3 凝血酶滴定法測定水蛭不同炮制品中抗凝血酶活性

取水蛭粉末(過40目篩)約1.0 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉5 mL，充分攪拌，浸提30 min，并時時振搖，調pH值至5.0，離心，精密量取上清液100μL，置試管(8 mm×38 mm)中，加入含0.5%牛纖維蛋白原(以凝同物計)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(取0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷25 mL與0.1 mol/L鹽酸約40 mL，加水100 mL，調節(jié)pH 7.4)200μL搖勻，置水浴(37±0.5)℃中緩緩滴加每1 mL中含10 U的凝血酶溶液(每4 min滴加1次，每次2μL，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液體積，結果見表2。

結果表明，水蛭生品和炮制品中游離氨基酸為0.51%～0.77%，游離氨基酸含量較低，各樣本之間的差異不大。水解氨基酸含量為24.7%～39.9%，各樣本之間有一定的差異，水解氨基酸含量螞蝗低于柳葉螞蟥；經過醋炙、酒炙，含量基本略有下降；滑石粉炒含量基本不變；砂炒、蜜炙麥麩炒含量略有增加。螞蟥和柳葉螞蟥的抗凝血酶活性差異不大，但是高溫炮制（砂炒、蜜炙麥麩炒、滑石粉炒）降低了柳葉螞蟥的抗凝血酶活性。

圖1 混合氨基酸對照品（A）、供試品中游離氨基酸（B）及水解氨基酸（C）HPLC圖

表2 水蛭氨基酸及抗凝血酶測定結果 （n=2）

3 討論

螞蟥和柳葉螞蟥，都為螞蟥屬Whimania動物，以食螺、蚌等軟體動物為生，不吮吸動物血液。螞蟥的游離氨基酸含量為0.64%，水解氨基酸含量為24.7%，柳葉螞蟥的游離氨基酸含量為0.74%，水解氨基酸含量為37.5%，說明水蛭所含的游離氨基酸較少，而大部分是以蛋白質或多肽形式存在。兩者的抗凝血酶活性相同，說明游離氨基酸和水解氨基酸的含量與抗凝血酶活性之間沒有必然的量的關系，經過高溫炮制的柳葉螞蟥的抗凝血酶活性比生品降低了，推測水蛭中抗凝血酶活性物質可能是的體內存在的某種特定的小分子多肽類物質或者多肽類有效部位，這些物質遇熱會發(fā)生降解或者變性，影響藥效的發(fā)揮。

范尚坦等[5]研究表明，參照2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載用凝血酶滴定法測定水蛭藥材中的含量，提取液的pH對測定結果產生非常大的影響，按藥典方法得到的水蛭提取液的pH在3.0左右，會導致纖維蛋白原析出，無法證明水蛭有抗凝血酶活性，將提取液的pH調到5.0，水蛭的抗凝活性最佳，因此參考該文獻在藥典方法的基礎上增加一步調節(jié)提取液pH到5.0，從而避免假陽性干擾，能真實評價水蛭的抗凝血酶活性。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：77-78.

[2]程新法，喻 新.水蛭的綜合研究近況[J].中醫(yī)文獻雜志，1997（3）：44-45.

[3]文洪宇，龍順伯，羅 怡.水蛭炮制方法演變[J].中國藥業(yè)，2009，18（20）：71-73.

[4]謝 誼，易 艷，劉 陽，等.柱前衍生HPLC測定阿膠中17種水解氨基酸含量[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2012，32（5）：46-49.

[5]范尚坦，李金蘭，張 勇，等.水蛭中水蛭素含量測定的改進[J].中國中藥雜志，2008，33（19）：2 277-2 279.