丹參酮ⅡA對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用及機(jī)制

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院普外科，河北 石家莊 050011

丹參酮ⅡA對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用及機(jī)制

趙雪峰 賈楠 李勇 范立僑 王冬

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院普外科，河北 石家莊 050011

背景與目的：有研究證實(shí)，丹參酮ⅡA (tanshinone ⅡA)對腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)分化和促凋亡的作用，并可抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲。但丹參酮ⅡA抑制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。本研究主要探討丹參酮ⅡA對人胃癌SGC7901細(xì)胞體外遷移和侵襲的影響。方法：不同濃度(0.5、1、2、4 μg/mL)丹參酮ⅡA分別作用體外培養(yǎng)的胃癌SGC7901細(xì)胞24、48、72 h后，MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活力的改變；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力的改變；3D侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力的改變；Real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分別檢測細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)mRNA和蛋白的表達(dá)水平改變。結(jié)果：1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA對胃癌細(xì)胞株SGC7901有明顯的抑制作用，且抑制作用存在時間-劑量依賴性(P＜0.05)；2 μg/mL丹參酮ⅡA呈時間依賴性抑制SGC7901細(xì)胞遷移；1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA呈濃度依賴性抑制SGC7901細(xì)胞侵襲；丹參酮ⅡA下調(diào)SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達(dá)，同時可上調(diào)TIMP-2表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論：丹參酮ⅡA可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲，上調(diào)TIMP-2的表達(dá)，下調(diào)ICAM-1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，可能是其作用機(jī)制之一。

丹參酮ⅡA；胃癌；遷移；侵襲

［Key words］Tanshinone ⅡA; Gastric cancer; Migration; Invasion

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在中國和亞洲其他國家發(fā)病率較高［1-2］。胃癌的治療仍以手術(shù)和化療為主［3］。術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，而復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要原因在于胃癌細(xì)胞有很強(qiáng)的侵襲遷移能力。因此，抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移成為胃癌治療的重要環(huán)節(jié)。丹參酮是從丹參中提取的化合物，其中丹參酮ⅡA是脂溶性成分的代表。近年丹參酮ⅡA的抗腫瘤活性受到高度重視。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA抑制胃癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化［4-5］。另有研究顯示，丹參酮ⅡA可抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲［6］。本研究旨在體外觀察丹參酮ⅡA對人胃癌SGC7901細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并對其分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

SGC-7901細(xì)胞為人胃癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)研究院上海細(xì)胞研究所。胎牛血清、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶，購自美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和丹參酮ⅡA(TanⅡA)(純度＞99%)購自Sigma公司；3D侵襲小室購自美國Costar公司；ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2抗體購自Santa Cruz公司；TRIzol試劑為美國invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；Real-time PCR試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。Real-Time PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品；PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下恒溫溫育。每3天用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化以1∶3的比例傳代。

1.3 MTT法檢測

SGC7901細(xì)胞以5×103個/mL密度接種于96孔板，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的丹參酮ⅡA (0.5、1、2、4 μg/mL)分別處理細(xì)胞24、48、72 h，對照組加入0.1% DMSO。每組設(shè)置6個復(fù)孔。各實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入20 μL的MTT(濃度為5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO室溫振蕩15 min溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀于波長490 nm測吸光度值(A值)，以A值表示SGC7901細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

消化后，胃癌SGC7901細(xì)胞懸液以4×105個/mL密度接種于6孔板，100%匯合后，吸盡培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌1次，沿孔板底部劃一直線，用PBS洗去刮下的SGC7901細(xì)胞，將含2 μg/mL丹參酮ⅡA的培養(yǎng)基加入6孔板，對照組加入等量0.1% DMSO的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72 h后，顯微鏡下任意取6個視野，計(jì)數(shù)越過劃痕的細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞數(shù)代表腫瘤細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 3D侵襲實(shí)驗(yàn)

用100 μL Matrigel膠覆蓋3D侵襲小室上室，在超凈臺中用紫外線照射2 h，使Matrigel膠充分聚合。用0.25%胰蛋白酶消化，丹參酮ⅡA(1、2、4 μg/mL)作用16 h，對照組加入等量0.1% DMSO的培養(yǎng)基，調(diào)整濃度至4×105個/mL，每組分別吸200 μL接種于上室，小室置于24孔板內(nèi)，下室加含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)24 h。取出小室，棉簽擦掉上室的Matrigel膠和細(xì)胞，甲醇固定膜10 min，結(jié)晶紫染色，高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)6個視野中的細(xì)胞數(shù)，以細(xì)胞數(shù)代表腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 總RNA提取及Real-time PCR

SGC7901細(xì)胞以5×103個/mL密度接種于6孔板，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h，用1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA作用48 h，溶劑對照加入0.1%DMSO。收集各組細(xì)胞，用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度儀測定RNA濃度及純度，并經(jīng)電泳鑒定后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參照。ICAM-1上游引物：5’-GGCTGGAGCTGTTTGAGAAC-3’，下游引物：5’-ACTGTGGGG TTCAACCTCTG-3’；MMP-2上游引物：5’-CCGTGGTGAGATCTTCTTCT-3’，下游引物：5’- CCTCGTATACCGCATCAATCT-3’；MMP-9上游引物：5’-CTGGCACCACC ACAACATCAC-3’，下游引物：5’-TACACGCGAGTGAAGGTGAGC-3’；TIMP-2上游引物：5’-TATCTACACG GCCCCCTCCT-3’，下游引物：5’-CCTCGGCCTTTCCTGCAAT-3’；GAPDH上游引物5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。根據(jù)實(shí)時熒光定量擴(kuò)增曲線獲取目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，以目的基因ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2表達(dá)的相對定量值(RQ值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

SGC7901細(xì)胞以5×103個/mL密度接種于6孔板，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24 h，1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA作用48 h，溶劑對照加入0.1%DMSO。收集各組細(xì)胞，用裂解緩沖液(50 mmol/L Tris pH=7.2，1% Triton X-100，0.5%草酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉，500 mmol/L NaCl，10 nmol/L MgCl2，10 mg/mL亮抑肽酶，10 mg/mL抑肽酶和1 mmol/L PMSF)裂解整個細(xì)胞，細(xì)胞總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜在5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)各目標(biāo)分子特異性一抗4 ℃過夜，接著，用辣根過氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗室溫溫育2 h。ECL法檢測結(jié)合的目的條帶。以GAPDH作為內(nèi)參照，用目的蛋白ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2的吸光度(A)值/內(nèi)參照A值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以x±s 表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行ANOVA分析處理和Dunnett檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹參酮ⅡA抑制SGC7901細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA對胃癌細(xì)胞以濃度和時間依賴的方式抑制細(xì)胞生長(P＜0.05，表1)。

表 1 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞增殖的影響(x±s)Tab. 1 Effects of Tan ⅡA on the proliferation of SGC7901 cell lines (x±s)

2.2 丹參酮ⅡA抑制SGC7901細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，2 μg/mL丹參酮ⅡA組隨著作用時間的延長，細(xì)胞遷移能力逐漸下降，呈明顯的效應(yīng)-時間依賴關(guān)系(P＜0.05，表2，圖1)。

表 2 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞遷移的影響(x±s)Tab. 2 Effects of Tan ⅡA on the migration of 7901 cell lines (x±s)

2.3 丹參酮ⅡA抑制SGC7901細(xì)胞侵襲

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA組細(xì)胞侵襲能力逐漸下降，呈明顯的效應(yīng)-濃度依賴關(guān)系(P＜0.05，表3)。

圖 1 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞遷移的影響Fig. 1 Effects of Tan ⅡA on the migration of SGC7901 cell lines

表 3 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞侵襲的影響(x±s)Tab. 3 Effects of Tan ⅡA on the invasion of SGC7901 cell lines (x±s)

2.4 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)分子表達(dá)的影響

Real-time PCR和Western blot分析結(jié)果顯示，與對照組相比，2、4 μg/mL丹參酮ⅡA組細(xì)胞內(nèi)ICAM-1、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，TIMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)；1 μg/mL丹參酮ⅡA組細(xì)胞內(nèi)ICAM-1 mRNA和ICAM-1、MMP-2蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，TIMP-2 mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05，表4、5，圖2)。

圖 2 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2蛋白的影響Fig. 2 Effects of Tan ⅡA on the protein level of SGC7901 cell lines

表 4 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9和TIMP-2 mRNA的影響(x±s)Tab. 4 Effects of TanⅡA on the ICAM-1, MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 mRNA level of SGC7901 cells(x±s)

表 5 丹參酮ⅡA對SGC7901細(xì)胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白的影響(x±s)Tab. 5 Effects of TanⅡA on the protein levels ICAM-1, MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 in SGC7901 cell lines(x±s)

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤惡化的結(jié)果，而遷移和侵襲能力的增強(qiáng)則是發(fā)生轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。丹參酮ⅡA具有廣泛的生理作用，如抗炎和抗氧化作用等［7］，其中對心腦血管病的研究取得了顯著的成績，受到國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。近年來有研究表明，丹參酮ⅡA可抑制骨肉瘤和肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［6,8］，而丹參和赤芍則能促進(jìn)大鼠移植瘤模型肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生［9］。由于腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)各異，藥物作用的機(jī)制差別很大。因此，本研究觀察了丹參酮ⅡA對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用和可能的機(jī)制，以深化對丹參酮ⅡA抗腫瘤作用的認(rèn)識。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，主要包括細(xì)胞黏附、蛋白降解和移動3個步驟，其中，黏附是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的始動因素，而ICAM-1具有介導(dǎo)細(xì)胞間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間黏附的功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞ICAM-1表達(dá)水平較高；而丹參酮ⅡA作用后，ICAM-1表達(dá)明顯下調(diào)。腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲與多種轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族成員多是降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白水解酶類，其中以MMP-2和MMP-9與胃癌的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，以丹參酮ⅡA作用胃癌SGC7901細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)。金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是MMPs的抑制劑，可通過與MMPs非共價結(jié)合抑制其對基底膜的降解。本研究顯示，丹參酮ⅡA作用與SGC7901細(xì)胞后，可上調(diào)TIMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)，提示丹參酮ⅡA可通過不同途徑抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，丹參酮ⅡA可上調(diào)TIMP-2的表達(dá)、下調(diào)ICAM-1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，且具有抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。然而，更深層次分子機(jī)制及信號途徑等尚未明確，隨著研究的不斷深入，丹參酮ⅡA作為臨床潛在的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤機(jī)制會得到更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Tanshinone ⅡA inhibites migration and invasion of human gastric cancer SGC7901 cells

ZHAO Xue-feng, JIA Nan, LI Yong, FAN Li-qiao, WANG Dong (Department of General Surgery, the Fourth Affiliated Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050051, China)

LI Yong E-mail: li_yong_hbth@126.com

Background and purpose: Recently, it was reported that tanshinone ⅡA (TanⅡA) could inhibit proliferation, induce differentiation and apoptosis of human cancer cells. Previous studies also indicated that TanⅡA could inhibit the migration and invasion of osteosarcoma. However, the effects of TanⅡA on the migration and invasion of gastric cancer and the mechanism remains unclear. The aim of this study was to investigate the effect of TanⅡA on gastric cancer cell SGC7901 migration and invasion of in vitro. Methods: After different concentrations (0.5, 1, 2, and 4 μg/mL) of TanⅡA treatment for 24, 48, and 72 h respectively, MTT assay were developed to detect the cell proliferation of SGC7901. The wound healing assay and 3D-transwell assay were used to observe the migration and invasion of SGC7901 cells, respectively. Expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), and tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP-2) mRNA and protein were measured with real-time PCR and Western blot. Results: 1, 2, and 4 μg/mL Tan ⅡA showed a dose- and time- dependent growth inhibition on SGC7901 cells. 2 μg/mL Tan ⅡA showed a time-dependent migration inhibition of SGC7901 cells. 1, 2, and 4 μg/mL Tan ⅡA could inhibit the invasion of SGC7901 cells. Realtime PCR and Western blot showed a reduction in expression of ICAM-1, MMP-2, and MMP-9, as well as an increase in expression of TIMP-2 (P＜0.05).Conclusion: TanⅡA inhibits human gastric cancer SGC7901 cell migration and invasion in vitro. TIMP-2 upregulation and, ICAM-1, MMP-2, MMP-9 downregulation might be one of the mechanisms of anti-tumor of TanⅡA.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.003

R735.2

：A

：1007-3639(2013)10-0793-05

2013-03-04

2013-09-16）

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題(No：20130238)。

李勇 E-mail:li_yong_hbth@126.com