前列腺特異抗原3慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與包裝

劉曉軍王娜姚旭東曹達(dá)龍

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

前列腺特異抗原3慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與包裝

劉曉軍1王娜2姚旭東1曹達(dá)龍1

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3，PCA3)作為一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)已被證實(shí)在前列腺癌中高度特異性表達(dá)，暗示其可能在前列腺癌中發(fā)揮重要作用，為深入研究，我們將完整的PCA3基因轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體，并構(gòu)建慢病毒包裝系統(tǒng)。方法：從前列腺癌細(xì)胞株LNCaP細(xì)胞中提取總RNA，運(yùn)用重疊延伸方法擴(kuò)增到PCA3基因，測序正確后定向接入真核表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，酶切鑒定并測序正確后進(jìn)行慢病毒包裝和滴度測定。結(jié)果：經(jīng)PCR鑒定及測序，PCA3表達(dá)質(zhì)粒序列與Gene Bank序列進(jìn)行Blast比對分析，同源性為99.8%，PCA3慢病毒滴度測定為2×108。結(jié)論：PCA3成功插入真核表達(dá)載體并完成了慢病毒包裝，為深入研究PCA3基因在前列腺細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為探索前列腺癌的治療提供了新的途徑。

前列腺癌；前列腺癌抗原3；真核表達(dá)載體；慢病毒

前列腺癌基因3(prostate cancer gene 3，PCA3)是1999年被發(fā)現(xiàn)的一種長鏈非編碼RNA［1］。由于PCA3在前列腺癌中的表達(dá)具有特異性，它也被用于前列腺癌的早期診斷。已有研究發(fā)現(xiàn)，干擾PCA3在前列腺癌細(xì)胞株LNCap中的表達(dá)后可影響其增殖［2-3］，但PCA3的過表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞是否有作用還尚未研究。本文通過PCR擴(kuò)增PCA3，然后克隆到真核表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中，目的是構(gòu)建重組質(zhì)粒，用于后續(xù)研究PCA3在前列腺癌的增殖和侵襲中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

前列腺癌LnCap細(xì)胞株、DU145細(xì)胞株、PC3細(xì)胞株、TRIzol試劑由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α、慢病毒載體質(zhì)粒pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP、慢病毒包裝系統(tǒng)、病毒生產(chǎn)細(xì)胞系293T細(xì)胞由胡維國教授惠贈(zèng)。寡核苷酸引物由上海生工公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ、凝膠純化回收試劑盒均購自日本Takara公司，質(zhì)粒小抽試劑盒購自Tiangen公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank的人PCA3基因的序列(序列號：NR_015342.1)設(shè)計(jì)合成引物，因PCA3含3 735 bp，較難擴(kuò)增，而且為了保證序列的準(zhǔn)確性，本研究設(shè)計(jì)了3對引物，擴(kuò)増出3個(gè)片段命名為P1、P2、P3，其長度分別為1 263、1 245、1 368 bp，各片段間互相重疊，重疊片段為79及60 bp，便于以后的搭接。引物序列：第1片段P1上游引物F1：5’-ATAGGATCCAGAAGAA ATAGCAAGTGCCGAGAA-3’，下游引物R1：5’-ATAGCGGCCTTTACGTTCTGGGA TACATGT-3’；第2片段P2上游引物F2：5’-GACTAAGTCCTTTATCCCTCCCC-3’，下游引物R2： 5’-GGACTATCCATGAACAC AAAGAGGG-3’；第3片段P3上游引物F3:5’GC TCAGGTGCTTTCACTAATGTCTC-3’，下游引物R3：5’-CGCGGATCCCTTTACGTTCTGGGA TACATGTGCAG-3’，F(xiàn)1、R3引物兩端分別加上NotⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 RNA提取及PCR擴(kuò)增

采用TRIzol法從PCA3高表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞株LnCap中提取總RNA。取4 μL的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后取1 μL用高保真酶擴(kuò)增PCA3。反應(yīng)體系20 μL：5×buffer 4 μL，dNTP 2 μL，F(xiàn)1/R1(或F2/R2或F3/R3)：0.5/0.5 μL，cDNA：1 μL，HS DNA聚合酶：0.2 μL，ddH2O：11.8 μL擴(kuò)増出3個(gè)片段。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min， 98 ℃ 10 s，60 ℃15 s，72 ℃ 1.5 min，72 ℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后以1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。然后送測序，測序結(jié)果與GenBank中PCA3序列對比，發(fā)現(xiàn)序列基本吻合。重疊延伸反應(yīng)體系20 μL：5×buffer 4 μL，dNTP 2 μL，F(xiàn)2/R2：0.5/0.25 μL及F3/R3：0.25/0.5 μL，模板P2、P3各1 μL，HS DNA聚合酶：0.2 μL，ddH2O：10.3 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min，98 ℃10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 2.5 min，72 ℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后1%的瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。將連接好的后2個(gè)片段與第1個(gè)片段連接，反應(yīng)體系20 μL：5×buffer 4 μL，dNTP 2 μL，F(xiàn)1/R3：0.5/0.5 μL，模板P1、P2-P3各1 μL，HS DNA聚合酶：0.2 μL，ddH2O：10.8 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min， 98 ℃10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 4 min，72 ℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后1%的瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段并送測序。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

用NotⅠ、BamHⅠ分別雙酶切pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP、PCR膠回收產(chǎn)物PCA3分子過夜，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠后回收酶切片段。將回收的質(zhì)粒及目的片段以1∶3(摩爾比)進(jìn)行連接，連接體系10 μL，16 ℃過夜。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并培養(yǎng)，涂布于含氨芐青霉素的LB選擇平板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜。挑取白色克隆菌落，使用載體多克隆位點(diǎn)兩端的引物(F1、R3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃4 min，72 ℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)，檢測載體多克隆位點(diǎn)是否有插入目的基因片段。檢測為陽性菌落培養(yǎng)后用小抽試劑盒提質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，同時(shí)將質(zhì)粒進(jìn)行NotⅠ、BamHⅠ雙酶切，1%凝膠電泳鑒定，將酶切后和PCR的產(chǎn)物送Invitrogen公司測序，測序引物為3對引物。

1.2.4 慢病毒包裝及病毒滴度測定

慢病毒包裝：用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，感染前1天接種到6孔板中，使融合度達(dá)到70%～80%。取出2個(gè)干凈的1.5 mL EP管，各加入500 μL Opti-MEM培養(yǎng)液，將慢病毒包裝系統(tǒng)中兩種質(zhì)粒按一定比例與慢病毒載體混合加入其中1個(gè)EP管，另外1個(gè)EP管加入LipofectamineTM2000，3種質(zhì)粒的質(zhì)量與LipofectamineTM2000體積比為1∶1(含空載質(zhì)粒的病毒的包裝同上相同)。混合均勻后靜置5 min，然后將2管混合，靜置30 min。后將此復(fù)合物加入無血清培養(yǎng)液的293T細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后棄上清液，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后熒光顯微鏡觀察，48 h后收取上清液，72 h后再收集1次，于4 ℃條件下12 000×g離心20 min，然后使用0.22 μm濾器過濾，分裝于1.5 mL EP管中，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。采用逐孔稀釋滴度測定法將純化過的病毒液倍比稀釋后感染293T細(xì)胞，48 h熒光顯微鏡觀察熒光；用完全培養(yǎng)基按照10倍稀釋，最后得到稀釋病毒上清的體積均為100 μL。72 h后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)及感染

RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞DU145及PC3細(xì)胞株，細(xì)胞消化后按1×105/mL鋪在6孔板中，融合度達(dá)到70%～80%。吸除培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，加入30 μL的濃縮病毒，混勻后放入恒溫箱。24 h后更換普通培養(yǎng)液，72 h后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率。

1.2.6 RT-PCR檢測PCA3 mRNA的表達(dá)

用TRIzol法提取慢病毒感染DU145及PC3細(xì)胞的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCA3RT-PCR檢測前引物為：5’-AGAAGAAATAGC AAGTGCCGAGAAG-3’，后引物為：5’-GTGTGGCCTCAGATGGTAAAGTC-3’，β-actin作為內(nèi)參，使用TaKaRa的RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s 表示，樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因PCA3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

從LnCaP細(xì)胞中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板分別擴(kuò)增P1、P2、P3，然后P2、P3搭接，后再與P1進(jìn)行重疊延伸反應(yīng)擴(kuò)出全長。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，顯示在3 700 bp處有擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)期相符，表明目的基因克隆成功(圖1)。

圖 1 PCA3重疊延伸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis results of PCR products of PCA3

2.2 慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3測序及雙酶切鑒定

將擴(kuò)出的PCA3片段回收后，插入載體中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行菌液PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約3 735 bp的1條清晰的目的條帶，與預(yù)計(jì)片段相符合(圖2)。將質(zhì)粒載體送測序，測序結(jié)果顯示表達(dá)克隆中插入的目的基因序列與GenBank中PCA3基因的序列(序列號：NR_015342.1)基本相符，大小為3 735 bp，表明慢病毒載體pCDHCMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3構(gòu)建成功。從此陽性克隆株中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)NotⅠ、BamHⅠ雙酶切后可見2個(gè)片段，即約7 500 bp的慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP片段與3 735 bp的目的基因片段，說明重組質(zhì)粒大小及插入方向正確，重組載體構(gòu)建成功(圖3)。

圖 2 目的基因PCA3重組克隆PCR鑒定結(jié)果Fig. 2 PCR identification results of recombinant lentivirus-PCA3

2.3 慢病毒感染前列腺癌細(xì)胞后熒光表達(dá)

經(jīng)過病毒滴度測定，將空載體慢病毒或PCA3過表達(dá)慢病毒分別感染前列腺癌細(xì)胞株DU145及PC3細(xì)胞，細(xì)胞感染72 h后，使用熒光顯微鏡觀察，可觀察到綠色熒光，感染效率達(dá)90%以上(圖4)。

2.4 RT-PCR檢測慢病毒感染前列腺癌細(xì)胞株后PCA3 mRNA的表達(dá)

病毒感染細(xì)胞株96h后收取兩組細(xì)胞的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，后進(jìn)行real-time PCR檢測PCA3 mRNA的表達(dá)，相對于空載體感染組，PCA3過表達(dá)慢病毒組的PCA3 mRNA表達(dá)水平上升(P＜0.05)，表明PCA3過表達(dá)成功(圖5)。

圖 3 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3雙酶切鑒定圖Fig. 3 Double digestion identification results of pCDH-CMVMCS-EF1-copGFP-PCA3

圖 4 熒光顯微鏡觀察慢病毒對前列腺癌細(xì)胞株的感染效率Fig. 4 GFP expression in lentivirus infected prostate cancer cells

圖 5 RT-PCR 檢測過表達(dá)PCA3基因后前列腺癌細(xì)胞株P(guān)CA3 mRNA結(jié)果Fig. 5 Overexpression of PCA3 mRNA in prostate cancer cells with real time-PCR

3 討 論

前列腺癌基因3(PCA3)由Bussemakers等［1］于1999年應(yīng)用差異顯示分析比較前列腺癌組織和正常前列腺組織的mRNA表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)的。它位于第9號染色體上(9q21-22)，是一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)。報(bào)道稱多種類型的ncRNA通過對染色質(zhì)進(jìn)行修飾、DNA的甲基化、RNA剪接與編輯、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因的沉默、增強(qiáng)基因表達(dá)等各種途徑參與基因調(diào)節(jié)［4-5］。在許多生物體內(nèi)人們還發(fā)現(xiàn)了類mRNA樣的長ncRNAs，對于它們的功能的研究是較為熱門的領(lǐng)域，而PCA3在前列腺癌中的作用尤為備受關(guān)注。

Bussemakers等［1］在56個(gè)前列腺癌切除樣本中發(fā)現(xiàn)，有95%的樣本其PCA3在癌性組織相對于臨近的非癌性組織來說是過度表達(dá)的。使用RNA印跡分析來自同一對象的正常前列腺組織和良性前列腺增生(BPH)組織發(fā)現(xiàn)其幾乎不表達(dá)PCA3。用敏感的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析正常前列腺組織和BPH組織中的PCA3顯示也僅有較低水平的表達(dá)，然而在前列腺癌組織中PCA3表達(dá)水平較非惡性組織平均上調(diào)近60倍。此外，在其他組織和腫瘤中未發(fā)現(xiàn)PCA3［1,6］。初步的研究顯示，PCA3在前列腺癌中過表達(dá)，對于發(fā)現(xiàn)前列腺癌是一個(gè)潛在的標(biāo)志物。然而對于PCA3的功能研究鮮有報(bào)道，本課題組曾經(jīng)以前列腺癌細(xì)胞株LNCaP為研究對象，采用針對PCA3的特異干擾RNA轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCA3 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后能顯著抑制LNCaP細(xì)胞中PCA3的表達(dá)水平；運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖能力在PCA3 siRNA干擾組顯著低于陰性對照組，即在前列腺癌中細(xì)胞增殖是PCA3的調(diào)控效應(yīng)之一；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，干擾PCA3的表達(dá)能夠顯著減弱LNCaP細(xì)胞的克隆形成［2］。為了進(jìn)一步研究PCA3在前列腺癌細(xì)胞株中的作用，我們構(gòu)建了PCA3過表達(dá)病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3，為后期研究PCA3的功能及其與前列腺癌細(xì)胞的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前基因轉(zhuǎn)染途徑很多，而慢病毒是較為有效的一種，它具有毒力低、感染效率高、容納外源性基因片段大等特點(diǎn)。PCA3因分子片段較大，為3 735 bp，我們選擇慢病毒使其能將目的基因整合到靶細(xì)胞染色體中，并得以長期穩(wěn)定的表達(dá)該基因，因此是目前較為理想的基因治療載體系統(tǒng)［7］。

綜上所述，通過對重組體的酶切鑒定及測序，結(jié)果表明成功構(gòu)建了含有PCA3基因的慢病毒載體，為進(jìn)一步深入研究PCA3基因在前列腺中的作用機(jī)制，進(jìn)而為探索安全、高效的治療途徑奠定了重要基礎(chǔ)。

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Construction of eukaryotic expression vector and package of lentivirus vector encoding prostate cancer antigen 3

LIU Xiao-jun1, WANG Na2, YAO Xu-dong1, CAO Da-long1(1.Department of Urology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Department of Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College Fudan University, Shanghai 200032, China)

YAO Xu-dong E-mail: yaoxudong67@sina.com

Background and purpose: The increased of specific expression of prostate cancer antigen 3 (PCA3), as one of long non-coding RNA, has been observed in prostate cancer, indicating that PCA3 may contribute to the development of prostate cancer. To further study its roles in prostate cancer, we construct a lentivirus expression vector carrying the whole PCA3. Methods: PCA3 was amplified from prostate cancer cell line LNCaP by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). After the sequence was proved to be correct, we recombined the pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3. After transformation into E.coli cells, the candidate clones were identified by PCR amplifying, restricting enzyme digestion analysis and DNA sequencing, and the viral titer was determined. Results: Through the Blast analysis software, we compared the results of PCA3 sequence amplified by PCR with GeneBank sequence, finding that the homology is 99.8%. The lentivirus vector was constructed successfully, and the virus in the supernatant reached a titer of 2*108. Conclusion: The successful construction of the lentivirus vector encoding PCA3 not only lays the foundation for the further research into the effect of PCA3 gene on the prostate cancer but also provides a new therapy for advanced prostate cancer.

Prostate cancer; Prostate cancer antigen 3; Eukaryotic expression vector; Lentivirus

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.001

R737.25

：A

：1007-3639(2013)11-0857-06

2013-06-13

2013-10-09）

國家自然科學(xué)基金(No：81272836)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)上海市自然科學(xué)基金(No：11ZR1407400)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)上海市醫(yī)學(xué)引導(dǎo)類項(xiàng)目(No：114119a4200)。

姚旭東 E-mail:yaoxudong67@sina.com