HPLC法對(duì)康復(fù)新液中肌苷的含量測定

劉向芳 劉 幸 王 璐 劉安惠

云南省昆明市第三人民醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650041

HPLC法對(duì)康復(fù)新液中肌苷的含量測定

劉向芳 劉 幸 王 璐 劉安惠

云南省昆明市第三人民醫(yī)院藥劑科，云南 昆明 650041

目的：建立康復(fù)新液中肌苷含量測定的HPLC測定法。方法：采用VP－ODS色譜柱，以甲醇－水（5∶95）為流動(dòng)相；檢測波長：248nm。結(jié)果：肌苷在4～16g·m l－1濃度范圍線性關(guān)系良好，平均回收率（n＝9）為97.43%，RSD＝1.70%。結(jié)論：測定方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為提高康復(fù)新液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測項(xiàng)目。

康復(fù)新液；肌苷；含量測定；高效液相色譜法

康復(fù)新液是用美洲大蠊提取物制成的液體制劑，具有通利血脈，養(yǎng)陰生肌之功效，主要含氨基酸、嘧啶堿類等物質(zhì)，其中肌苷是康復(fù)新液中已知的主要成分之一。原標(biāo)準(zhǔn)［1］只收載康復(fù)新液中總氨基酸含量測定項(xiàng)，本文采用高效液相色譜法對(duì)其肌苷進(jìn)行定量檢測，對(duì)提高本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了探討，測定方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為提高康復(fù)新液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測項(xiàng)目。

1 儀器與試藥

島津LC－2010A高效液相色譜儀：LC－10ATvp紫外檢測器：Class－vp色譜工作站；

肌苷對(duì)照品（含量：99.2%，中國藥品生物制品檢定所），批號(hào)：140669－200401；

康復(fù)新液（規(guī)格：100m l／瓶昆明賽諾制藥有限公司研究所制備），批號(hào)：12091207；

甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：VP－ODS柱（4.6mm×150mm，5um）；甲醇－水（5：95）為流動(dòng)相；流速：0.8 m l／min；檢測波長為248nm；進(jìn)樣量10μl；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取肌苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1m l含0.01mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取本品20m l，加三氯甲烷12m l，精密加入1mol／l鹽酸3.4m l，攪拌至析出晶體完全溶解，置分液漏斗中，棄去三氯甲烷，再分別用三氯甲烷8ml重復(fù)洗滌二次，棄去三氯甲烷，精密量取2ml，置10m l量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3 方法學(xué)考察

3.1 專屬性試驗(yàn) 按處方量稱取不含美洲大蠊提取物的各種原輔料，制備空白溶液，按供試品溶液的制備方法制備空白對(duì)照溶液。取對(duì)照品溶液、空白樣品溶液及供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示對(duì)照品、供試品溶液圖譜的肌苷峰，保留時(shí)間約7.50，空白對(duì)照溶液圖譜在相應(yīng)位置沒有吸收峰（見色譜圖1），表明專屬性良好。

3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液（濃度：0.1008mg／m l）0.4、0.7、1、1.3、1.6m l置10m l量瓶中，加水稀釋到刻度，搖勻，分別吸取10μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（μg／m l）為橫坐標(biāo)，作線性回歸，回歸方程為：Y＝31838X－1195.3（r＝0.9995），結(jié)果顯示肌苷進(jìn)樣量在4～16μg／m l范圍呈良好的線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗(yàn) 取同一肌苷對(duì)照品溶液（0.1008mg／m l），連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以肌苷的峰面積計(jì)算，RSD＝0.24%。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品20 m l，按供試品溶液制備方法制備6批供試品溶液，分別測定含量，以測得樣品含量計(jì)算，RSD＝0.59%（n＝6），表明本方法重復(fù)性好。

3.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液樣品，按上述檢測方法，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h進(jìn)樣測定。結(jié)果12小時(shí)內(nèi)測得峰面積的RSD值為1.96%（n＝6），表明供試品溶液中肌苷在室溫條件下放置12小時(shí)穩(wěn)定。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量為0.05215 m m l的樣品10m l共9份，分為三組，每組分別精密加入含量為0.1008mg／m l的對(duì)照品貯備液4.5 m l、6.0 m l、7.5m l，加1mol／L的鹽酸1.7m l，照供試品溶液的制備方法制備樣品，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.7 樣品含量測定 取10個(gè)批次的樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備溶液，精密吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液各10μl分別注入高效液相色譜儀，樣品含量結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝10）

4 討論

4.1 色譜條件的確定 選擇248nm為檢測波長，以甲醇－水（10：90）為流動(dòng)相，流速1.0m l／m in，對(duì)照品的保留時(shí)間僅3.592；流動(dòng)相比例調(diào)整為甲醇－水（5：95），流速0.8 m l／min，對(duì)照品保留時(shí)間7.733，理論塔板數(shù)6770，符合檢測要求。

4.2 供試品溶液制備 康復(fù)新液中含防腐劑苯甲酸鈉，如果樣品不經(jīng)處理，對(duì)肌苷含量測定會(huì)帶來很大干擾，關(guān)鍵點(diǎn)在于除去溶液中的苯甲酸鈉。苯甲酸可溶于三氯甲烷，苯甲酸鈉在酸性條件下可轉(zhuǎn)化為苯甲酸；而肌苷不溶于三氯甲烷，易溶于稀鹽酸中［2］，根據(jù)這些特性，加入適量鹽酸，就可把康復(fù)新液中的苯甲酸鈉轉(zhuǎn)化成苯甲酸溶于三氯甲烷中而分離出來。通過多次考察試驗(yàn)，康復(fù)新液20m l，加1mol／L的鹽酸3.4ml，分別用三氯甲烷12ml、8ml、8ml萃取洗滌三次即可。

4.3 方法學(xué)考察 該方法具有精密度高，回收率、專屬性好，符合《中國藥典》2010年版一部附錄VID高效液相色譜法的各項(xiàng)要求，可作為提高康復(fù)新液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測項(xiàng)目。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑第十九冊(cè)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998：176.

［2］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版二部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：277.

HPLC method for the determ ination of inosine of kangfuxin Liquid

LIU Xiang-fang，LIU Xing，WANG Lu，LIU An-hui Third people's hospital of Kunming，Kunmin 650041

Objective：to establish the determination of inosine content of Kangfuxin Liquid in the determination of HPLC. M ethods：using VP－ODScolumn，methanolwater（5：95）asmobile phase，the detection wavelength：248 nm.Resu lts：inosine in 416g·m l－1concenentration range good linear relationship，the average rate of recovery was 97.43%，RSD＝1.70%（n＝9）.Conclusion：themethod is simp le，accurate，can be used to improve the detection of project quality standard Kangfuxin liquid.

Kangfuxin Liquid；Inosine；Content determination；HPLC

R927.2

A

1007－8517（2013）21－0009－02

2013.09.27）