血府逐瘀湯對人臍靜脈內皮細胞一氧化氮適度刺激作用的研究

林 凡劉林梅練祝明劉如玉吳世代

（1福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福州，350122；2福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州，350122）

血府逐瘀湯對人臍靜脈內皮細胞一氧化氮適度刺激作用的研究

林 凡1劉林梅2練祝明2劉如玉1吳世代1

（1福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福州，350122；2福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州，350122）

目的：探討血府逐瘀湯對人臍靜脈內皮細胞一氧化氮（Nitric oxide，NO）產生的影響。方法：以人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell-12，HUVEC-12）為材料，采用不同血府逐瘀湯含藥血清濃度和干預時間處理HUVEC-12，檢測細胞培養(yǎng)上清液中NO濃度的變化。結果：與空白對照組對比，血府逐瘀湯可在一定干預時間段，適度誘導HUVEC-12胞外NO的產生（P＜0.05）。結論：血府逐瘀湯可能通過適度刺激人內皮細胞NO產生，發(fā)揮促進血管新生作用，又避免增生過度的不良反應。

血府逐瘀湯；人內皮細胞；一氧化氮；適度刺激

血府逐瘀湯出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯》，由桃紅四物湯合四逆散而成。因瘀阻于胸，妨礙肝之疏泄，疏暢肝氣有利于祛瘀，故配四逆散。方中牛膝能祛瘀血、通經脈，并有引瘀血下行的作用；桔梗與枳殼相配，一升一降，行氣寬胸，有使氣行血暢之功。在中醫(yī)藥現代臨床上，該方常用于缺血性心腦血管疾病的治療，如心絞痛、冠心病等［1］。近年來，血府逐瘀湯對血管新生的促進作用成為該方應用研究的一個新熱點［2-5］。NO是一個重要的血管新生調控分子，有報道表明血府逐瘀湯可影響內皮細胞NO的產生［6］。但血府逐瘀湯對人內皮細胞產生NO的影響是短效行為還是長期效應，這尚無明確研究。本研究旨在探討血府逐瘀湯影響人內皮細胞產生NO的模式，為該藥物在血管新生方面的研究提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物 血府逐瘀湯中各藥量分別為：當歸9 g、生地黃9 g、桃仁12 g、紅花9 g、枳殼6 g、赤芍6 g、柴胡3 g、甘草6 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g、牛膝9 g。以上藥材購于福建省中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂。該方水煎兩次，煎液過濾，混合后濃縮至含生藥量1.3 g／m L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 含藥血清制備 根據文獻［7］制備，主要步驟如下：SD大鼠，6周齡，體重（200±20）g，SPF級，雌雄各半，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。適應性喂養(yǎng)3d后，隨機分為對照組和藥物組（血府逐瘀湯組）。藥物組按13 g／kg（相當于10倍的人臨床用量）劑量灌胃，對照組采用等量生理鹽水，每天2次，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃2 h后，采血并分離血清，滅活補體并過濾除菌后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑及設備 胰蛋白酶（Trypsin）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）和DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；一氮化氮檢測試劑盒（S0021）購自碧云天生物技術研究所；其余試劑均為國產分析純；IX70倒置相差顯微鏡及數碼攝像裝置為OLYMPUS公司產品，二氧化碳培養(yǎng)箱產于Heraeus公司，ELX800全自動酶標儀為BioTek公司產品，細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購于Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUVEC-12的培養(yǎng) HUVEC-12細胞株由本實驗室保存，培養(yǎng)。采用DMEM高糖培養(yǎng)液（含10%FBS），置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分泌NO濃度的檢測 將對數生長期的HUVEC-12以2×105個／m L的密度接種于細胞培養(yǎng)6孔板。同步化處理后，隨機分組，分別用含有不同濃度的含藥血清或空白對照血清干預。到達干預培養(yǎng)時間時，收集各組培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書所述方法進行測定。

1.3 統(tǒng)計分析 利用SPSS 11.5軟件對實驗中所得數據作Duncan（Duncan’smultiple range test）多重檢驗。

2 實驗結果

2.1 血府逐瘀湯含藥血清對HUVEC-12產生NO的刺激作用 與相應濃度的空白對照組相比較，不同濃度（1.25%，2.5%和5%）含藥血清干預24 h均刺激內皮細胞NO的分泌（P＜0.01）。其中，2.5%含藥血清干預效果最為明顯，見表1。這一結果提示，血府逐瘀湯含藥血清對內皮細胞NO的產生具有刺激作用，這種刺激作用存在最適藥物作用濃度。

表1 不同濃度（%）血府逐瘀湯含藥血清對HUVEC-12分泌NO的刺激作用（）

表1 不同濃度（%）血府逐瘀湯含藥血清對HUVEC-12分泌NO的刺激作用（）

注：與空白對照組相同血清濃度比較，**P＜0.01。

組別例數血清濃度／%胞外NO濃度／（μmol／L）血府逐瘀湯4 1.25 16.52±2.35**含藥血清組4 2.5 22.64±6.31**4 5 14.17±2.01**空白對照組4 1.25 5.34±0.07 4 2.5 5.31±0.83 4 5 5.64±0.51

圖1 2.5%血府逐瘀湯含藥血清干預時間對HUVEC-12產生NO的影響

2.2 血府逐瘀湯含藥血清干預時間對HUVEC-12產生NO的影響 2.5%的空白對照血清干預48 h內，細胞分泌的NO含量無顯著變化。而2.5%含藥血清處理能引起內皮細胞胞外NO濃度的顯著上升，此刺激作用是一個溫和、短期效應。具體而言，2.5%含藥血清可誘導細胞NO產生，在干預6 h后，細胞培養(yǎng)上清液中的可檢測NO濃度有顯著上升（P＜0.05），24 h時達到高峰，隨即開始下降，48 h時藥物誘導效應消失，如圖1所示。

3 討論

NO主要是由細胞內一氮化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）催化底物L-精氨酸形成的一種氣體信號分子。在血管內皮細胞中，內皮型一氮化氮合酶（endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS）被證明參與調節(jié)內皮細胞遷移與血管生成［8］。本研究表明，含藥血清（1.25%，2.5%和5%）處理人臍靜脈內皮細胞（24 h），能顯著制激NO的產生。這同其他研究者的報道相吻合［6］。這一結果表明，血府逐瘀湯促血管新生的效果可能與激活內皮細胞eNOS產生NO有關。一系列研究表明，NO調節(jié)血管新生的作用與血管內皮生長因子（Vascular Endothelial growth Factor，VEGF）信號途徑密切相關。VEGF作用于其受體VEGFR-2后，通過PI3K／Akt-PKB［9］或PKA途徑［10-11］，改變eNOS磷酸化水平［12］，調節(jié)eNOS活性，刺激內皮細胞NO的產生。另一方面，內皮調節(jié)型一氮化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）也可受缺氧等條件誘導，參與VEGF的表達調控［13］。NO還可通過誘導內皮細胞表面的血管舒張來調節(jié)血管生成因子的作用，使內皮細胞層在血管生成因子或促細胞遷移因子的作用下呈現出正常的響應，調節(jié)血管生成［14］。有報道證實VEGF持續(xù)的促血管新生作用會加快動脈粥樣硬化［15-17］，增加腫瘤形成和轉移的風險，提高其他血管生成源性疾病的機率［18-19］。而血府逐瘀湯在臨床實踐中則未有相關不良反應的報道。這提示血府逐瘀湯在誘導血管新生的過程中，不是單純、持續(xù)式刺激NO產生，可能存在較為復雜的模式，具體行為必需描述明確。

本研究結果表明，血府逐瘀湯對血管內皮細胞NO產生的誘導作用是一種溫和、短期的模式。具體而言，在含藥血清干預一段時間后促進內皮細胞NO的產生，刺激效應在24 h后開始下降，48 h時回復至空白對照組水平。血府逐瘀湯對內皮細胞NO產生的適度刺激效應，可能使其在促進血管新生的同時，避免了血管過度增生。這可能是其沒有西藥治療所產生的不良反應的因素之一。

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（2013-03-12收稿）

Study on M oderate Stimulation Function of Xuefu Zhuyu Decoction on Levels of Nitric Oxide Released from Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Lin Fan1，Liu Linmei2，Lian Zhuming2，Liu Ruyu1，Wu Shidai1
（1 College of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China；2 College of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China）

Objective：To investigate effects of Xuefu Zhuyu Decoction（XFZYD）on levels of Nitric oxide（NO）released from Human Umbilical Vein Endothelial cells.Methods：Endothelial cells HUVEC-12 were incubated with blank serum or XFZYD containing serum（XFZYD-CS）at different concentrations and different times.Thereafter，the NO concentrations in the culture supernatant liquid were determined.Resu lts：Compared with the control group，XFZYD-CShas amoderate stimulatory effecton NO production of thisendothelial cell line in a period of time.Conclusion：Xuefu Zhuyu Decoctionmoderately increases the endothelial NO concentration to promote angiogenesis without causing overgrown blood vessels.

Xuefu Zhuyu Decoction；Endothelial cell；Nitric oxide；Moderate stimulation

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.11.023

國家自然科學基金項目（編號：81102844）；福建省自然科學基金項目（編號：2010J05070）；福建省教育廳資助項目（編號：JA11134）；福建中醫(yī)藥大學校管項目（編號：X2009064）