血管內皮生長因子在實驗性分泌性中耳炎大鼠中耳粘膜的表達

李希平 戴海江 趙守琴 范爾鐘 劉仲燕 魏永祥

血管內皮生長因子在實驗性分泌性中耳炎大鼠中耳粘膜的表達

李希平1戴海江2趙守琴2范爾鐘3劉仲燕3魏永祥1

目的探討血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與分泌性中耳炎（otitis media with effusion，OME）的關系。方法 50只健康的SD大鼠隨機分為實驗組（30只）及對照組（20只），均以右耳為實驗耳，左耳作正常對照。兩組實驗耳分別經聽泡注入來源于綠膿桿菌的內毒素（endotoxin，ET）35μl（實驗組）和等量生理鹽水（saline，NE）（對照組），于術后6小時、1天、3天、7天及14天各處死實驗組動物6只和對照組動物4只，用HE染色觀察兩組動物中耳粘膜的病理變化，SABC免疫組織化學染色檢測中耳粘膜中VEGF的表達。結果 實驗組術后6小時術耳中耳粘膜上皮下間隙增厚，術后1天時增厚更顯著并見炎性細胞浸潤，中耳腔可見炎性細胞滲出，以多形核中性白細胞為主，3天時上述改變達高峰，7天時僅見上皮下間隙增厚且明顯減輕，14天時基本恢復正常；對照組術耳未見明顯異常改變。實驗組術耳于術后1、3天時在部分中耳粘膜上皮細胞、炎性細胞、血管內皮細胞中見VEGF陽性表達，7天時僅在部分血管內皮細胞有陽性表達，術后6小時及14天、對照組及實驗組正常對照耳中耳粘膜均未見陽性表達。結論 細菌內毒素能誘導大鼠急性OME，其病理改變3天時達高峰，14天基本恢復；VEGF可能參與了OME急性期的中耳炎癥反應。

血管內皮生長因子； 分泌性中耳炎； 模型，動物

分泌性中耳炎（otitis media with effusion，OME）的發(fā)病機理十分復雜，至今尚無定論。細胞因子是炎癥細胞和組織產生的糖蛋白，在免疫和炎癥過程中起著重要的調節(jié)作用，其與OME的關系是近十年來該領域的研究熱點。總的來說，細胞因子可分為致炎因子和生長因子兩大類，分別具有致炎及刺激組織增生的作用。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是生長因子家族中的重要成員，近年來關于其在腫瘤及其他新生物形成過程中的作用已有大量報道［1，2］，但對其在OME發(fā)病機制中的作用研究較少。本實驗采用SABC免疫組化染色方法檢測其在OME動物模型中耳粘膜的表達，旨在探討其在OME發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 50只健康的SD大鼠，體重250～300克，雌雄不拘。實驗前所有動物耳廓反射正常，手術顯微鏡下檢查雙側鼓膜均正常。隨機分為實驗組（30只）和對照組（20只），分別于右側中耳腔內注射35μl來源于綠膿桿菌的細菌內毒素（endotoxin，ET）（實驗組）和等量生理鹽水（對照組），兩組左耳均作為正常對照耳，不作任何處理。

1.2 主要儀器及試劑 手術顯微鏡（Olympus）50微量加樣器。ET購自Sigma公司，為綠膿桿菌菌屬，產品編號L-9143，10 mg包裝，在無菌操作臺用無菌NS配制成1 mg／ml后以50μl分裝于安培管凍存?zhèn)溆?。VEGF單克隆抗體（北京中山公司提供），SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司提供）。

1.3 OME大鼠造模方法 大鼠以氯胺酮（1mg／kg）加芬太尼肌肉注射麻醉后仰臥位固定。頸部備皮，取右側下頜骨內緣切口，小心鈍性分離暴露聽泡。以微量加樣器抽取35μl ET經聽泡壁輕輕刺入中耳腔，再距此穿孔2毫米處輕刺破聽泡，以平衡注射時中耳腔壓力，防止鼓膜破裂，注射完后用骨蠟封閉兩孔，縫合切口。觀察鼓膜確無破裂并見積液征后手術結束，送動物房分籠飼養(yǎng)。對照組右耳同法注入生理鹽水35μl。

1.4 動物標本采集及染色 于術后6小時、1天、3天、7天、14天分別取實驗組動物6只及對照組動物4只，深麻醉后斷頭暴露聽泡往聽泡內注入10%的福爾馬林溶液50μl，將聽泡完整取下，10%的福爾馬林溶液中固定12小時，10%的中性EDTA溶液中脫鈣約20天，酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，各取半數聽泡沿水平位與冠狀位方向以4μm層厚切片，行常規(guī)HE染色和SABC法免疫組化染色。染色步驟按試劑盒說明書進行，VEGF免疫組化染色以PBS代替一抗作為陰性對照，以細胞胞漿呈棕黃色染色為陽性表達判斷標準。

2 結果

2.1 組織學觀察 實驗組術后6小時術耳中耳粘膜上皮下間隙增厚，1天時增厚更明顯并見炎性細胞浸潤，中耳腔可見炎性細胞滲出，以多形核中性白細胞為主，3天時上述改變達高峰，7天時僅見上皮下間隙增厚，且明顯減輕，14天時基本恢復正常。正常對照耳及對照組未見明顯異常改變（圖1～4）。

2.2 VEGE在兩組動物中耳粘膜的表達 實驗組術耳術后6小時VEGF無陽性表達，1天時在部分纖毛上皮細胞及中性粒細胞見陽性表達，3天時在中性粒細胞中表達明顯增強，7天僅在部分纖毛上皮細胞見陽性表達，14天時未見陽性表達。正常對照耳及對照組均未見陽性表達（圖5～8）。

3 討論

OME的重要特征是滲出液積聚于中耳腔，關于滲液產生的機理，目前研究表明參與OME發(fā)病過程的炎癥介質有組胺、花生四烯酸代謝產物、P物質、血管活性腸肽、血小板激活因子等［3～6］，它們都有擴血管及增加血管通透性的作用，從而造成滲液的潴留。VEGF是目前已知的最強的促血管通透劑，其生物學作用是組胺的5萬倍［7］，其生物學效應包括增強血管通透性、促進血管內皮細胞增殖和促進血管形成，但其在OME發(fā)病過程中的作用不甚明了。新近研究［8］顯示，VEGF在急性中耳炎大鼠的中耳粘膜中表達上調，微泵持續(xù)灌注VEGF可明顯促進灌注區(qū)中耳粘膜的血管生成。在胃液誘發(fā)的兔中耳炎模型中同樣發(fā)現VEGF在中耳粘膜的表達增加［9］。更為直接的證據是，在46份分泌性中耳炎患者的中耳滲液中VEGF檢出率高達100%，并與內毒素水平明顯相關，且VEGF在粘液性滲液中的濃度高于在漿液性滲液中的濃度［10］，充分說明VEGF與中耳炎滲液的形成有關。

圖1 正常大鼠鼓室前壁單層扁平上皮（HE×200）

圖5 實驗組造模后1天時VEGF在上皮細胞（黑箭頭所示）、中性粒細胞（白色箭頭所示）中的表達（免疫組化×400）

圖2 實驗組造模1天鼓室黏膜炎癥反應，黏膜上皮下間隙增厚，炎癥細胞浸潤滲出（HE×200）

圖3 實驗組造模第3天鼓室黏膜炎癥反應，黏膜上皮下間隙增厚更著，炎癥細胞浸潤滲出更重（HE×200）

圖4 實驗組造模第14天鼓室黏膜恢復情況，上皮層仍明顯厚于正常，炎癥反應消退（HE×200）

圖6 實驗組造模后3天時VEGF在大量中性粒細胞（黑色箭頭）中的表達（免疫組化×400）

圖7 實驗組造模后7天時VEGF在上皮細胞中微弱表達（免疫組化×400）

圖8 陰性對照組VEGF未見表達（免疫組化×400）

1999年Jung［7］首次報道在ET誘導的大鼠OME中耳粘膜中檢測到了VEGF的表達，并通過RT-PCR技術檢測到慢性中耳炎患者的中耳粘膜中有VEGF表達。他推測VEGF增加血管通透性及刺激內皮細胞增殖的作用可能對中耳炎的發(fā)生發(fā)展產生了一定促進作用。研究顯示，ET可以刺激上皮細胞及血管平滑肌細胞產生VEGF，并被認為是VEGF的主要來源［11，12］。本實驗結果顯示VEGF在中耳粘膜纖毛上皮細胞中表達的同時，在中性粒細胞中的陽性表達十分明顯，與Jung的研究結果相近。Webb［13］研究發(fā)現人類激活的中性粒細胞可以表達VEGF，結合本實驗結果，推測OME模型中激活的中性粒細胞可能是VEGF的重要來源，VEGF產生后增加了血管通透性，可能對分泌性中耳炎的滲液形成起到了關鍵作用。Kim［14］將重組VEGF 1.0μg注入大鼠鼓室成功誘發(fā)了中耳黏膜的炎癥反應，并產生了中耳滲液，進一步證明VEGF對滲液形成的作用。VEGF主要通過與VEGF受體結合起作用，受體分VEGFR-1和VEGFR-2兩種，Chae［15］在內毒素誘導的分泌性中耳炎模型中取不同時間點的中耳黏膜采用RT-PCR檢測VEGFR-1和VEGFR-2的表達，發(fā)現在造模后1小時和3天其表達均上調，表達高峰出現在12小時及1天。

近年來ET和VEGF之間的關系已引起了研究者的興趣。Sugishita［16］在培養(yǎng)液中加入ET培養(yǎng)新生大鼠的心室肌細胞，以研究ET對VEGF表達和分泌的影響，發(fā)現10μg的ET在1小時內迅速增加了細胞內VEGFmRNA的水平，ET作用6小時后培養(yǎng)基中VEGF的濃度也顯著增加，他推測VEGF參與了ET誘導的炎癥反應過程。Itaya［17］研究巨噬細胞在ET刺激下產生VEGF的機制，發(fā)現可能有P38-MAP激酶途徑介導，地塞米松可以抑制蛋白的產生，但卻不能抑制mRNA的產生。說明ET與VEGF的產生有因果關系。

綜上所述，推測OME患者有可能因為細菌ET的存在導致鼓室黏膜的炎性反應，不斷刺激產生VEGF，造成血管通透性增加，導致滲液形成。今后進一步研究VEGF與其他細胞因子之間的相互作用和不同病程OME患者中耳滲液中VEGF的表達水平對闡明OME的發(fā)病機理和指導臨床治療將具有重要意義。

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9 Ba?ogˇlu MS，Eren E，Aslan H.Increased expression of VEGF，iNOS，IL-1β，and IL-17 in a rabbit model of gastric content -induced middle ear inflammation［J］.Int JPediatr Otorhinolaryngol，2012，76：64.

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12 Williams B，Quinn-Baker A，Gallacher B，et al.Serum and platelet-derived growth factor-induced expression of vascular permeability factor by human vascular smooth muscle cells in vitro［J］.Clin Sci（Colch），1995，88：141.

13 Webb NJ，Myers CR，Watson CJ，et al.Activated human neutrophils express vascular endothelial growth factor［J］.Cytokine，1998，10：254.

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15 Chae SW，Kim SJ，Kim JL，et al.Expression of vascular endothelial growth factor receptors in experimental otitis media in the rat［J］.Acta Otolaryngol，2003，123：559.

16 Sugishita Y，Shimizu T，Yao A，et al.Lipopolysac-charide augments expression and secretion of vascular endothelial growth factor in rat ventricular myocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，268：657.

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（2012-09-20收稿）

（本文編輯 雷培香）

Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Rat Experimental

Otitis Media with Effusion Li Xiping*，Dai Haijiang，Zhao Shouqin，Fan Erzhong，Liu Zhongyan，Wei Yongxiang
（*Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Beijing Anzhen Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing，100029，China）

Objective To study the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and its relationship with otitis media with effusion（OME）.Methods Fifty healthy Sprague-Dawley rats of either sex（250～300 mg）were randomly devided into experimental group（LPS group，30 rats）and control group（NS group，20 rats）. Thirty-fiveμl volume of 1 mg／ml endotoxin（ET）from pseudomonas aeruginosa and the same amount of saline（NS）were injected into the right tympanic bullas of the two groups transbullaly.Six rats from LPS group and 4 rats from NS group were killed on postoperative 6 h，1 d，3 d，7 d，14 d respectively.The temporal bones were harvested for histology and VEGF SABC immunohistochemical analysis.The left tympanic bullas served as control.Results The epithelial layer and subepithelial space thicked mildly in ET group at 6 h，and more heavily at 1 d with inflammatory cells infiltration（mostly polymorphonuclear leukocytes）throughout them.At 3 d，the same changes were observed most severely.By 14 d，the mucosal lining became normal，while no obvious changes were observed in the NS group.Immunostaining of VEGF in normal rat middle ear and NS-treated mucosa revealed no expression.VEGF postitive staining was observed in ciliated cells，some inflammatory cells（mostly PMNs），vascular endothelial cells at 1 dand became strongest at 3 d and then weakily identified in few vascular endothelial cells by 7 d.No expression was observed at 6 h and 14 d.Conclusion Endotoxin can induce OME，with inflammatory changes peak at day 3 and return to normal by day 14.VEGF participates in the course of acute inflammatory reponse of OME and may play an important role in the pathogenesis of OME.

Vascular endothelial growth factor； Otitis Media，with effusion； Model，animals

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.018

時間：2013-7-3 16：56

R764.21

A

1006-7299（2013）04-0387-04

1 首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京 100029）； 2 首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科； 3 北京市耳鼻咽喉科研究所

李希平，男，山東人，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為耳科基礎與臨床，睡眠呼吸暫停綜合征的微創(chuàng)治療。

魏永祥（weiyongxiang＠vip.sina.com）

網絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130703.1656.008.html