超聲實(shí)時(shí)組織彈性成像評價(jià)大鼠肝纖維化分期

肝纖維化甚至早期肝硬化具有可逆性，早期診斷肝纖維化，有效地阻斷或干預(yù)肝纖維化進(jìn)程具有重要意義。目前肝臟活檢是診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]，但其為有創(chuàng)檢查、穿刺部位局限，患者不易接受。本實(shí)驗(yàn)采用超聲實(shí)時(shí)組織彈性成像（RTE）建立大鼠肝纖維化模型，獲得不同纖維化程度的肝臟應(yīng)變比（SR），分析SR與病理肝纖維化分期的相關(guān)性，探討一種無創(chuàng)評價(jià)肝纖維化分期的新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康Wistar大鼠80只，雄性，體重280～300 g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔級，置于溫度18～23℃、相對濕度40%～70%的屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，飼喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。采用抽簽法選取64只大鼠為實(shí)驗(yàn)組，制作大鼠肝纖維化模型；另外16只為對照組。

1.2 動物模型建立 實(shí)驗(yàn)組大鼠首次按4 ml/kg經(jīng)腹腔注射60% CCl4橄欖油溶液，以后每周3次按2 ml/kg注射。對照組大鼠首次按4 ml/kg經(jīng)腹腔注射生理鹽水，以后每周3次按2 ml/kg注射。分別于第4周、6周、8周、10周采用抽簽法隨機(jī)從實(shí)驗(yàn)組中取16只、從對照組中取4只大鼠進(jìn)行肝臟RTE檢查。

1.3 大鼠肝臟RTE檢查 檢查前大鼠禁食水8 h，采用10%水合氯醛按3 ml/kg腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定于平板上，剪去肝區(qū)體毛。采用日立HV900彩色多普勒超聲診斷儀，配備彈性成像軟件包，使用線陣探頭行超聲掃查，頻率6～13 MHz。①先用二維成像模式常規(guī)掃查肝臟，觀察肝實(shí)質(zhì)回聲改變。②將大鼠開腹并充分暴露肝臟，在肝臟表面加蓋硅膠墊（要求透聲性好，有一定彈性，厚度約0.5 cm，聲速接近于人體軟組織平均值，能夠反復(fù)使用），涂耦合劑使硅膠墊與探頭之間無空氣存留。選取大鼠肝右葉切面（均勻的肝實(shí)質(zhì)回聲區(qū)，盡量避開肝臟血管和膽道），開啟彈性成像功能，選取感興趣區(qū)，包括硅膠墊及2 cm深度肝組織，在探頭軸向上輕微震動加壓，壓力分?jǐn)?shù)控制在3，獲取穩(wěn)定彈性圖像，凍結(jié)。③選擇“Strain Ratio”測量項(xiàng)，用方形取樣框在彈性圖像內(nèi)分別獲取肝臟部位應(yīng)變值（A）和硅膠墊部位應(yīng)變值（B），自動獲得B/A值，即SR。解凍，重新獲取另一幅彈性圖像，測量3次后取平均值。

1.4 病理檢查 完成RTE檢查后，以脊椎脫臼法處死大鼠，剪取肝右葉，立即以10%甲醛固定48 h以上，石蠟包埋，行4 μm厚連續(xù)切片、HE染色、Masson染色、網(wǎng)狀纖維染色。病理科消化專業(yè)醫(yī)師在未知超聲彈性應(yīng)變比結(jié)果的情況下對肝纖維化程度進(jìn)行分析。

1.5 肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2000年全國病毒性肝炎病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，將肝纖維化分為5期：S0，無纖維化；S1，匯管區(qū)擴(kuò)大纖維化，局限竇周及小葉內(nèi)纖維化；S2，匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；S3，大量纖維間隔形成伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4，早期肝硬化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，不同肝纖維化分期組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法。超聲彈性評價(jià)結(jié)果與病理分期結(jié)果行Spearman相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型建立情況 對照組16只大鼠全部成活，飲食正常，體重增加，毛發(fā)光澤。實(shí)驗(yàn)組大鼠食量減少，精神狀態(tài)不佳，體重下降，毛發(fā)多汗無光澤，其中55只造模成功，9只大鼠給藥2周后陸續(xù)死亡。

2.2 病理表現(xiàn) 對照組大鼠肝臟表面光滑，肝緣銳利，顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟；鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無變性、壞死，無纖維間隔形成。實(shí)驗(yàn)組大鼠病理肝纖維化分期：S0期2只，S1期19只，S2期10只，S3期10只，S4期14只。S1期鏡下見肝細(xì)胞點(diǎn)、灶狀壞死；S2期可見中央靜脈、匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成；S3期可見大面積肝細(xì)胞變性壞死，中央靜脈周圍及匯管區(qū)大量纖維間隔形成，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂；S4期見正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，纖維間隔包繞形成假小葉。

2.3 RTE結(jié)果 大鼠肝纖維化病理分期及SR結(jié)果見表1和圖1～4。各纖維化分期組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.08,P＜0.001），其中S0期與S1期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；S0期與S2期、S3期、S4期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；S1期與S2期、S3期、S4期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；S2期與S3期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；S2期與S4期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；S3期與S4期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 RTE結(jié)果與肝纖維化分期的相關(guān)性 RTE應(yīng)變比與肝纖維化分期呈顯著正相關(guān)（r=0.799,P＜0.05）。隨肝纖維化程度加重，RTE應(yīng)變比隨之增加。

表1 各期肝纖維化彈性成像應(yīng)變比比較

3 討論

3.1 肝纖維化的影像診斷 影像學(xué)檢查是目前診斷肝纖維化最簡單易行的方法之一，能客觀、無創(chuàng)、真實(shí)地還原肝臟受累部位及了解肝臟形態(tài)，廣泛應(yīng)用于臨床。超聲、CT、MRI及核醫(yī)學(xué)均可以從形態(tài)學(xué)以及血流、彈力、代謝、功能等方面加強(qiáng)對肝纖維化的診斷和認(rèn)識，在肝纖維化診斷中具有重要作用。二維超聲檢查能顯示肝臟切面的形態(tài)、大小、肝實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)及管道系統(tǒng)；彩色多普勒超聲能顯示肝臟的血流，并對其血流動力學(xué)進(jìn)行測定；聲學(xué)造影能有效增強(qiáng)肝臟的二維超聲信息，反映正常組織和病變組織不同的血流灌注、造影劑分布和影像動態(tài)變化。在顯示肝臟整體解剖和肝臟與相鄰組織關(guān)系以及在動態(tài)增強(qiáng)掃描和功能性檢查方面，CT和MRI均具有明顯優(yōu)勢。CT灌注成像和MRI頻譜分析對肝纖維化的診斷有一定作用，但其臨床意義有限。

圖1 A. S0期肝纖維化大鼠Masson染色鏡下見肝細(xì)胞無明顯變性壞死，少量脂肪浸潤，匯管區(qū)無炎癥細(xì)胞浸潤（×100）；B.參照物與該大鼠肝臟的應(yīng)變比為0.43

圖2 A. S1期肝纖維化大鼠Masson染色鏡下見小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞腫脹，匯管區(qū)擴(kuò)大，炎癥細(xì)胞浸潤（×100）；B.參照物與該大鼠肝臟的應(yīng)變比為0.42

圖3 A. S2期肝纖維化大鼠Masson染色鏡下見肝細(xì)胞水腫，中央靜脈周圍及匯管區(qū)周圍纖維間隔形成（×100）；B.參照物與該大鼠肝臟的應(yīng)變比為0.68

圖4 A. S4期肝纖維化大鼠Masson染色鏡下見正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，大量纖維間隔包繞形成假小葉（×100）；B.參照物與該大鼠肝臟的應(yīng)變比為0.93

3.2 RTE評價(jià)肝臟纖維化的原理 肝臟纖維化級別與彈性模量的相關(guān)性極高[3]，彈性模量是指材料在外力作用下產(chǎn)生單位彈性變形所需要的應(yīng)力，如果能夠準(zhǔn)確測量出肝的彈性模量，就能夠獲得纖維化級別這一重要臨床信息。

1991年，Ophir等[4]首先提出超聲彈性成像的概念。目前，日立公司開發(fā)的RTE為壓迫性彈性成像，彈性模量小、受壓后位移變化大的組織顯示為紅色，彈性模量大、受壓后位移變化小的組織顯示為藍(lán)色，彈性模量中等的組織顯示為綠色，從而以圖像色彩較客觀地反映組織的硬度[5,6]。本實(shí)驗(yàn)觀察的變量是同一硅膠墊與各期纖維化大鼠肝臟的應(yīng)變比，并與病理結(jié)果相比較。應(yīng)變是指在外力作用下物體的變形量與原來尺寸的比值。應(yīng)變比工具是在感興趣區(qū)內(nèi)獲取兩個(gè)取樣框內(nèi)應(yīng)變的比值，它能夠不受主觀因素影響得到兩物體在外力作用下形狀的改變量。實(shí)驗(yàn)中使用的硅膠墊在水溫19℃、超聲頻率2 MHz下測得聲速為1417 m/s，與人體軟組織均值1540 m/s接近，不影響后方肝臟成像，并且有一定的形變能力，可以反復(fù)使用。測量同一恒定參照物與各期纖維化肝臟的應(yīng)變比，更能客觀、有效地反映肝臟硬度的變化。

3.3 RTE評價(jià)肝臟纖維化的價(jià)值 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RTE應(yīng)變比與肝纖維化分期呈顯著正相關(guān)（r=0.799,P＜0.05），隨著肝纖維化程度的加重，RTE應(yīng)變比相應(yīng)增加。除S0期與S1期、S2期與S3期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各期兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，根據(jù)應(yīng)變比大小可以將S1期、≥S2期、S4期區(qū)分診斷，提示RTE能夠比較準(zhǔn)確地診斷不同時(shí)期的肝纖維化，與裴書芳等[7]及Kanamoto等[8]的臨床研究結(jié)果基本一致。袁鷹等[9]通過結(jié)扎大鼠肝內(nèi)膽管制成膽汁淤積型肝纖維化模型，采用RTE分別觀察結(jié)扎7 d、結(jié)扎7 d及對照組（未結(jié)扎）的大鼠肝臟，結(jié)果證實(shí)膽管結(jié)扎14 d后大鼠肝纖維化形成，該組的彈性成像評分與另外兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RTE對于早期診斷大鼠肝纖維化有意義。

瞬時(shí)彈性成像是近年用于診斷肝纖維化的無創(chuàng)性新技術(shù)[10]，屬于一維超聲成像模式，不能實(shí)時(shí)產(chǎn)生二維圖像，因此檢查中無法確保避開脂肪、膽囊和血管等組織結(jié)構(gòu)的影響，并且由于脂肪組織將對低頻剪切波和超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的衰減作用，瞬時(shí)彈性成像不宜用于肥胖者及肋間隙過窄者[11]。聲輻射壓力脈沖可以實(shí)時(shí)呈現(xiàn)二維圖像，但其取樣框較?。?.6 cm×1.0 cm）。RTE在實(shí)時(shí)顯示彈性圖像的同時(shí)能同步觀察二維圖像，準(zhǔn)確定位感興趣區(qū)。Koizumi等[12]研究表明，RTE應(yīng)變比不受皮下脂肪厚度、體重指數(shù)和脂肪肝的影響，可以客觀地反映肝纖維化程度。

3.4 本實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)及局限性 本實(shí)驗(yàn)采用RTE應(yīng)變比評價(jià)肝纖維化程度，不同于以往根據(jù)取樣框內(nèi)顏色評分的方法[7,9]，能夠較客觀地反映肝組織硬度，并且以同一硅膠墊作為參照物，相比與自身脂肪或肌肉[8]對照更具有客觀性。本實(shí)驗(yàn)為動物實(shí)驗(yàn)，最終病理以整塊動物肝組織切片診斷，取樣面積大，代表性好。

盡管本實(shí)驗(yàn)中采用的硅膠墊聲速與人體軟組織接近，但它并非常規(guī)超聲診斷輔助設(shè)備，尚無統(tǒng)一的彈性標(biāo)準(zhǔn)，因此，本實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)無法與其他類似實(shí)驗(yàn)直接比較。此外，本實(shí)驗(yàn)為避免皮下軟組織干擾、直接獲取硅膠墊與大鼠肝臟的彈性信息，采用開腹成像，未來如何應(yīng)用于臨床，有待進(jìn)一步探討和完善。

總之，RTE為無創(chuàng)性診斷肝纖維化分期提供了一種新方法，對半定量評價(jià)肝纖維化具有較好的研究價(jià)值，有望為日后人體肝纖維化的研究提供初步參考。

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