姜黃素對非酒精性脂肪肝家兔肝組織TNF-α表達(dá)的影響

趙志光 周玲玲 林瓊瓊 周伶俐 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科 溫州 325000林梅瑟 浙江省溫州市中醫(yī)院ICU

姜黃素對非酒精性脂肪肝家兔肝組織TNF-α表達(dá)的影響

趙志光 周玲玲 林瓊瓊 周伶俐 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科 溫州 325000林梅瑟 浙江省溫州市中醫(yī)院ICU

目的：觀察姜黃素對非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）家兔的肝臟病理學(xué)變化及肝組織TNF-α表達(dá)水平的影響。方法：復(fù)制成功的NAFLD模型家兔34只隨機(jī)分為姜黃素組和模型組，各17只，均予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),治療組每天給予姜黃素200mg灌胃1次,模型組每天給予生理鹽水灌胃1次，治療1個月。免疫組織化學(xué)法分析TNF-α表達(dá)，觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果：姜黃素組TNF-α表達(dá)較模型組顯著降低（P＜0.05），肝炎癥活動及纖維化程度明顯好轉(zhuǎn)。姜黃素組TNF-α表達(dá)水平與肝炎癥活動度、纖維化呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：姜黃素可有效改善肝臟炎癥活動及纖維化程度，從而防治NAFLD。

非酒精性脂肪肝 腫瘤壞死因子α 肝纖維化 姜黃素

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。該病發(fā)病率逐年增高[1]，且研究表明是隱源性肝硬化的重要病因[2]，甚至可發(fā)展為肝癌[3-4]，但其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。目前臨床上藥物治療效果尚不理想。NAFLD發(fā)病基礎(chǔ)為脂質(zhì)代謝紊亂及異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，包括脂質(zhì)代謝異常及由此導(dǎo)致的異常細(xì)胞因子釋放，如脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子PPAR、SREBP-1c等，促炎因子TNF-α、IL-6等，以及促纖維化因子α-SMA、TGF-β等。近年研究證實(shí)姜黃素有抗炎、抗氧化、抗凝血、降血脂、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤等作用[5]。本研究以高脂飼料飼養(yǎng)并建立NAFLD家兔模型，觀察姜黃素對家兔NAFLD的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 日本大耳白家兔50只，雄性，體質(zhì)量1.8～2.2kg，2～3月齡，由溫州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，浙醫(yī)動字2200300002，并在該動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。高脂飼料組成:84%基礎(chǔ)飼料，10%豬油，5%紅糖，1%膽固醇（第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所）。

1.2 藥物及試劑 姜黃素由神威藥業(yè)有限公司提供。即用型TNF-α多抗購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 NAFLD模型復(fù)制 50只日本大耳白家兔給予基礎(chǔ)顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)選取10只家兔作為正常對照組繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，其余40只給予高脂飼料，單籠喂養(yǎng)，每天每兔進(jìn)食量為150g，飲水不限。造NAFLD模型過程中兔子死亡2只，8周后隨機(jī)抽取4只家兔處死，NAFLD模型組與正常對照組相比，TG、TC和LDL-C都顯著升高，說明已經(jīng)出現(xiàn)脂肪代謝紊亂;取肝組織病理檢查，4只家兔均表現(xiàn)出中-重度的脂肪變性，說明NAFLD模型成功建立。剩余34只NAFLD模型家兔隨機(jī)分成NAFLD模型組和姜黃素組，各17只。兩組均給予基礎(chǔ)顆粒飼料喂養(yǎng)，每天150g。姜黃素組每天給予姜黃素200mg/kg灌胃;對照組和模型組每天給予生理鹽水灌胃。每周稱重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，持續(xù)治療4周。實(shí)驗(yàn)周期共12周。

2.2 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時頸動脈放血處死動物，采血分離血清，部分肝組織于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱用于常規(guī)病理檢查及免疫組化測定。

2.3 肝組織病理學(xué)觀察 常規(guī)石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色、Van Gies?son（V-G）苦味酸酸性復(fù)紅染色，光鏡下觀察肝小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤、纖維增生及纖維間隔等病理變化。炎癥活動度半定量計(jì)分系統(tǒng)包括匯管區(qū)炎癥（P）、小葉內(nèi)炎癥（L）、碎屑壞死（PN）、橋接壞死（BN）4項(xiàng)，每項(xiàng)根據(jù)病變程度分別計(jì)0～4分，計(jì)分公式為P+L+ 2（PN+BN）。肝纖維化采用半定量計(jì)分系統(tǒng)[6]，包括小葉靜脈周/竇周（L）、匯管區(qū)（P）、纖維間隔數(shù)量（N）、纖維間隔寬度（W）4項(xiàng)，每項(xiàng)根據(jù)病變程度分別計(jì)0～4分，計(jì)分公式為L+P+2（N×W）。

2.4 肝組織免疫組化測定 免疫組織化學(xué)采用SP法，操作步驟參照說明書，用已知陽性片作為陽性對照，用PBS緩沖液液取代一抗作為陰性對照。TNF-α蛋白的陽性表達(dá)主要以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色者為準(zhǔn)，選擇具有代表性的多個高倍視野（× 400），采用IPP軟件計(jì)算平均光密度值（Mean Densi?ty）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肝組織炎癥活動度和纖維化程度 與正常對照組比較，模型組家兔肝組織匯管區(qū)可見較多炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞呈點(diǎn)狀、灶狀及碎屑樣壞死，偶見小葉中央靜脈、匯管區(qū)橋接壞死；姜黃素組治療后，肝組織炎癥活動計(jì)分和纖維化計(jì)分顯著低于治療前和模型組（P均＜0.05）；V-G染色顯示，與正常對照組比較，模型組肝組織可見中央靜脈周圍、竇周及匯管區(qū)內(nèi)纖維組織增生明顯,匯管區(qū)擴(kuò)大,偶見增生的纖維組織匯管區(qū)向小葉內(nèi)延伸,不完全分割肝小葉；姜黃素組治療后肝組織纖維化程度明顯減輕（P＜0.05），見表1。

表1 各組家兔肝組織炎癥活動度、纖維化計(jì)分比較（±s）

表1 各組家兔肝組織炎癥活動度、纖維化計(jì)分比較（±s）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05；與治療前比較，*P＜0.05

組 別n/只 炎癥活動度計(jì)分 纖維化計(jì)分正常對照組姜黃素組模型組10 17 治療前治療后17 治療前治療后1.25±0.27 16.69±6.12△△6.67±1.46*▲15.35±6.13△△10.23±4.56* 1.53±0.51 11.56±3.29△△3.68±1.90*▲12.32±3.12△△8.34±2.57*

3.2 各組家兔肝組織TNF-α表達(dá)水平 正常對照組TNF-α無明顯表達(dá)，NAFLD模型組TNF-α表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05），姜黃素組TNF-α蛋白表達(dá)顯著低于NAFLD模型組（P＜0.05），見表2。

表2 各組家兔肝組織TNF-α表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組家兔肝組織TNF-α表達(dá)水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05

組別n/只 治療前 治療后10 17 17正常對照組姜黃素組模型組0.05±0.05 0.52±0.08△0.54±0.10△0.07±0.04 0.18±0.07▲0.40±0.09

3.3 姜黃素組TNF-α表達(dá)與炎癥活動度、纖維化的關(guān)系 姜黃素組家兔肝組織TNF-α表達(dá)水平與肝組織炎癥活動度、纖維化呈顯著正相關(guān)（r=0.52，r=0.61，P＜0.05），見圖1。

圖1 姜黃素組TNF-α表達(dá)與炎癥活動度、纖維化相關(guān)分析

4 討論

腫瘤壞死因子α（TNF-α）源于單核-巨噬細(xì)胞，是參與慢性肝臟損傷重要的細(xì)胞因子之一。TNF-α的表達(dá)及血脂水平的升高與機(jī)體脂肪含量平行[7]。TNF-α可導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和凋亡[8]，且在肝纖維化形成過程中，對HSC的增殖、活化、合成細(xì)胞外基質(zhì)以及金屬蛋白酶及其組織抑制劑的釋放均有重要作用。增加的TNF-α與肝細(xì)胞膜上的TNF-αⅠ受體結(jié)合，進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，與線粒體等細(xì)胞器結(jié)合，激活某些蛋白酶并使磷脂酶A活性升高，自由基生成增加，引起肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，促進(jìn)肝細(xì)胞壞死及凋亡，趨化中性粒細(xì)胞，激活肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC），使HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，刺激肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化；也可增強(qiáng)HSC的趨化性，促進(jìn)其增殖，通過肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和壞死，間接促進(jìn)肝組織的纖維化[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂飲食所致的家兔NAFLD模型肝臟炎癥活動度、纖維化程度和TNF-α蛋白水平明顯升高；TNF-α蛋白與炎癥活動度、纖維化呈正相關(guān)。姜黃素治療后TNF-α蛋白含量相應(yīng)降低，肝臟脂肪變性逆轉(zhuǎn)，肝炎癥活動度和纖維化程度明顯減輕，顯示姜黃素具有治療NAFLD、預(yù)防和改善脂肪肝和肝纖維化的作用。其作用機(jī)制可能與姜黃素減少TNF-α的表達(dá)，抑制蛋白酶并使磷脂酶A活性降低，減少cyclinD1等細(xì)胞周期激活蛋白表達(dá)，增加P21等細(xì)胞周期抑制蛋白表達(dá)，從而減輕肝細(xì)胞壞死和肝組織炎癥，減少細(xì)胞因子相關(guān)性損害，抑制HSC的增殖和誘導(dǎo)HSC凋亡，達(dá)到預(yù)防NAFLD纖維化發(fā)生的作用。據(jù)報道[10]，家兔NAFLD模型PPARγ蛋白表達(dá)明顯減弱，姜黃素治療后PPARγ蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。國內(nèi)王戰(zhàn)建等[11]研究顯示，上調(diào)的PPARγ對TNF-α具有抑制作用。提示PPARγ與TNF-α的表達(dá)可能存在負(fù)相關(guān)，姜黃素可能通過上調(diào)PPARγ的表達(dá)抑制TNF-α，從而減輕脂肪變性、肝炎癥活動度和纖維化程度。

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TheEf fectsofCurcuminontheExpressionofTumorNecrosisFactor-alphainNon alcoholicFattyLiv?erDiseaseRabbits

ZHAOZh i guang，ZHOULi ng l i ng，LINQi ongq i ong，e t a l.Depa r tmen t o f Pa t ho l ogy,t he Se c?ond Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou(325000),China

Objective:To investigate the effects of curcumin on the pathological alterations and tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)of liver tissue in non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)rabbits.M ethods:Thirty-four rab?bits model of NAFLD were randomly divided into 2 groups:control group(17 animals)and treatment group(17 an?imals).Both groups were fed standard diet.The treatment group

oral curcumin at dose of 200mg·kg-1·d-1and the control group received equivalent oral curcumin-free sodium chloride solution once daily for 1 month. The expression of TNF-αprotein was measured by immunohistochemistry and the pathological alterations in the liver were examined.Results:Curcumin significantly decreased the expression of TNF-αprotein(P＜0.05)and alle?viated the severity of inflammation and fibrosis in the liver sections.The expression of TNF-αprotein was posi?tively correlated with scores of inflammation and fibrosis.Conclusion:Curcumin can improve the hepatic inflam?mation and hepatic fibrosis of NAFLD rabbits.

non-alcoholic fatty liver disease TNF-α hepatic fibrosis curcumin

2012-11-26