Bcl-2基因抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

韓貴和 魏 威 顧 軍 汪翼凡 應(yīng)小樟 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院骨科 杭州310003

·論 著·

Bcl-2基因抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

韓貴和 魏 威 顧 軍 汪翼凡 應(yīng)小樟 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院骨科 杭州310003

目的：觀察原癌基因bcl-2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用。方法：培養(yǎng)PC12細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用100感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）的攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒及未攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒感染PC12細(xì)胞。再將其分為A、B、C、D四組，A組為攜帶bcl-2基因慢病毒質(zhì)粒的PC12細(xì)胞（bcl-2-PC12細(xì)胞），B組為未攜帶bcl-2基因慢病毒質(zhì)粒PC12細(xì)胞（NC-PC12細(xì)胞），C組為bcl-2慢病毒質(zhì)粒PC12細(xì)胞加H2O2（bcl-2-PC12細(xì)胞+H2O2），D組為NC慢病毒質(zhì)粒PC12細(xì)胞加H2O2（NC-PC12細(xì)胞+H2O2）。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，采用BCA（bicinchoninic acid）法檢測(cè)bcl-2基因表達(dá)蛋白。結(jié)果：A組細(xì)胞凋亡率低于B組（P＜0.05），C組細(xì)胞凋亡率低于D組（P＜0.05）；A組bcl-2基因蛋白濃度高于B組（P＜0.05），C組bcl-2基因蛋白濃度高于D組（P＜0.05）。結(jié)論：bcl-2基因?qū)φＩ窠?jīng)細(xì)胞的凋亡有抑制作用，能夠增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的抗損傷能力。

bcl-2基因 神經(jīng)細(xì)胞 凋亡

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如截癱和四肢癱。目前尚無一種方法能使SCI患者的神經(jīng)功能得以明顯恢復(fù)?；蛑委煟╣ene therapy）是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究迅猛發(fā)展的領(lǐng)域之一［1-2］，有望改善SCI患者的神經(jīng)功能。自1997年Chen等發(fā)現(xiàn)原癌基因bcl-2能促進(jìn)哺乳動(dòng)物切斷的中樞神經(jīng)軸突的再生后，眾多學(xué)者對(duì)bcl-2基因的作用進(jìn)行了探索，并且取得了令人矚目的研究進(jìn)展［3-4］。PC12細(xì)胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的神經(jīng)細(xì)胞株，常用于實(shí)驗(yàn)研究。本研究對(duì)bcl-2基因抑制PC12細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)其抗損傷的作用做了一些探索，獲得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、H2O2（無錫市晶科化工有限公司）、胎牛血清（FBS，蘭州民海生物有限公司）、馬血清（HS，美國(guó)Hyclone公司）、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）、Alexa Flour 488 annexin V∕Dead Cell Apoptosis Kit（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（3111型，美國(guó)Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（DMIL型，德國(guó)Leica公司）、臺(tái)式離心機(jī)（上海醫(yī)療器械有限公司）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）、電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3 PC12細(xì)胞和慢病毒質(zhì)粒 PC12細(xì)胞（購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)）、攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒（bcl-2慢病毒質(zhì)粒，購(gòu)于上海吉瑪生物公司）、不攜帶bcl-2基因的慢病毒質(zhì)粒（NC慢病毒質(zhì)粒，購(gòu)于上海吉瑪生物公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐復(fù)蘇PC12細(xì)胞，10%FBS+ 5%HS，1×青-鏈霉素DMEM培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，傳代2～3次使細(xì)胞完全恢復(fù)。

1.5 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞胰酶消化，1 200r∕min離心5min，收集細(xì)胞，以DMEM完全培養(yǎng)基輕輕吹打混勻細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×105∕孔細(xì)胞量鋪布6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁后細(xì)胞匯合度50%左右，換新鮮培養(yǎng)基準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。用100感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）病毒感染PC12細(xì)胞。

1.6 H2O2損傷細(xì)胞 將轉(zhuǎn)染bcl-2慢病毒質(zhì)粒的PC12細(xì)胞及轉(zhuǎn)染NC慢病毒質(zhì)粒的PC12細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×105∕孔細(xì)胞量鋪布6孔培養(yǎng)板，各組細(xì)胞棄舊培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，換上無血清DMEM孵育24h使細(xì)胞同步化。棄舊培養(yǎng)液，PBS液清洗2次。將上述兩種細(xì)胞分為A、B、C、D四組，即A組為單純bcl-2慢病毒質(zhì)粒PC12細(xì)胞（bcl-2-PC12細(xì)胞），B組為單純NC慢病毒質(zhì)粒PC12細(xì)胞（NC-PC12細(xì)胞），C組為bcl-2慢病毒質(zhì)粒PC12細(xì)胞加H2O2（bcl-2-PC12細(xì)胞+ H2O2），D組為NC慢病毒質(zhì)粒PC12細(xì)胞加H2O2（NC-PC12細(xì)胞+H2O2）。C、D組細(xì)胞以1mmol∕LH2O2作用1h對(duì)其進(jìn)行損傷。

1.7 PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化上述細(xì)胞，1 200r∕min離心5min，收集細(xì)胞，用4℃PBS液洗滌2次，加入100μL1Xannexin-binding buffer溶解，按照凋亡檢測(cè)試劑盒操作，依次加入5μLAnnexin V和1μL100μg∕m lPI，孵育15min，再加入400μL1Xannexin-binding buffer后上機(jī)檢測(cè)。

1.8 Western blot法檢測(cè)bcl-2基因表達(dá)蛋白

1.8.1 蛋白樣品制備 吸取細(xì)胞培養(yǎng)液1mL，備用。每瓶細(xì)胞加2mL 4℃的PBS，輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。用胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集至備用的4℃細(xì)胞培養(yǎng)液中。1 200r∕min離心5min，收集細(xì)胞，小心吸除上清液。PBS洗滌1次，吸除上清液后加1mLPBS重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，1200r∕min離心5min，收集細(xì)胞。按1mL裂解液加10μL PMSF（100mM），混合均勻。每瓶細(xì)胞加100μL含PMSF的裂解液，在4℃下裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解，EP管要經(jīng)常搖動(dòng)。裂解完畢，于4℃、12 000r∕min離心10min。將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，于-70℃條件下保存。

1.8.2 BCA（bicinchoninic acid）法測(cè)定蛋白濃度將0.5mg∕mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20μL分別加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μL。樣品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋一定濃度后加20μL到96孔板中。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻，各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30min。測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先做正態(tài)性分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。細(xì)胞凋亡的分布符合二項(xiàng)分布，故細(xì)胞凋亡率的比較采用U檢驗(yàn)。蛋白濃度服從正態(tài)分布，進(jìn)行F檢驗(yàn)，成組資料t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 bcl-2基因?qū)C12細(xì)胞凋亡率的影響 A組細(xì)胞凋亡率8.11%較B組15.63%低（U=2.16，P＜0.05），C組細(xì)胞凋亡率12.27%較D組26.38%低（U=2.38，P＜0.05）。說明bcl-2基因可抑制PC12細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)PC12細(xì)胞的抗損傷能力，見圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡率圖示

2.2 bcl-2基因?qū)C12細(xì)胞表達(dá)蛋白的影響 A組bcl-2基因表達(dá)蛋白濃度高于B組（t=2.87，P＜0.05），說明A組存活細(xì)胞數(shù)多，bcl-2基因表達(dá)蛋白濃度高，bcl-2基因具有抗凋亡作用。C組bcl-2基因表達(dá)蛋白濃度高于D組（t=2.87，P＜0.05）。說明在細(xì)胞受到損傷時(shí)，bcl-2基因表達(dá)蛋白濃度高的細(xì)胞，抗損傷能力強(qiáng)，證明bcl-2基因具有增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的抗損傷作用。見表1。

表1 bcl-2蛋白濃度（） μg∕L

表1 bcl-2蛋白濃度（） μg∕L

注：與D組比較，△P＜0.05

組別A組B組C組D組n 10 10 10 10蛋白濃度0.56±0.02 0.46±0.02 0.32±0.02△0.18±0.02

3 討 論

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙如截癱和四肢癱。SCI造成的影響比較廣泛，可影響到運(yùn)動(dòng)、呼吸、消化、泌尿和生殖系統(tǒng)等多個(gè)器官的正常功能。目前，國(guó)內(nèi)外在脊髓損傷的綜合治療方面主要采取以下兩個(gè)策略：①在急性期使用神經(jīng)保護(hù)劑，以阻止損傷的進(jìn)一步發(fā)展。這種療法包括提高氧合能力、清除自由基及各種生化紊亂。②在亞急性期和后期使用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neurotrophic factors，NTF）以防止神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)匱乏并促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，也可聯(lián)用神經(jīng)元移植和遺傳工程細(xì)胞導(dǎo)入的方法；同時(shí)采用與髓鞘形成有關(guān)的抑制蛋白抗體來促進(jìn)軸突的長(zhǎng)距離再生能力。遺憾的是，目前尚無一種方法能使SCI患者的功能得以明顯恢復(fù)。

基因治療（gene therapy）是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞，以最終達(dá)到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的的治療方法。原癌基因Bcl-2是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的癌基因。1997年Chen等發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因能促進(jìn)切斷的哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)軸突的再生，第一次為脊髓損傷后的神經(jīng)元再生提供了理論依據(jù)［5］。Takahashi等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷后注射攜帶Bcl-2基因的DNA質(zhì)粒能減少神經(jīng)元的凋亡。Shimazaki等［7］利用腺伴隨病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-2基因至中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo)基因治療中樞神經(jīng)損傷—腦缺血再灌注損傷的可能性。已有大量文獻(xiàn)［8-10］表明，無論體內(nèi)還是體外，bcl-2基因?qū)τ趽p傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染攜帶bcl-2慢病毒的PC-12細(xì)胞組（A組）凋亡率低于未攜帶bcl-2慢病毒的PC-12細(xì)胞組（B組）（P＜0.05）。bcl-2基因表達(dá)蛋白濃度測(cè)定顯示，A組高于B組（P＜0.05），說明bcl-2基因?qū)φC12細(xì)胞的凋亡有抑制作用，能延長(zhǎng)PC12細(xì)胞的壽命。C組（bcl-2-PC12+H2O2）細(xì)胞凋亡率低于D組（NC-PC12+H2O2）（P＜0.05），bcl-2基因表達(dá)蛋白濃度高于D組（P＜0.05），證明bcl-2基因能夠增強(qiáng)PC12細(xì)胞的抗損傷能力。盡管有大量的研究證明bcl-2基因有抗細(xì)胞凋亡作用，能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗損傷的能力，但bcl-2基因轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，有可能導(dǎo)致細(xì)胞無限制生長(zhǎng)，使機(jī)體罹患癌癥。

［1］Blits B，BungeMB.Directgene therapy for repair of the spinal cord［J］.JNeurotrauma，2006，5（3-4）:508-520.

［2］Lavdas AA，Papastefanaki F，Thomaidou D，etal.Schwann Cell Transplantation for CNSRepair［J］.Curr Med Chem，2008，15（2）:151-160.

［3］Seki T，Hida K，TadaM，etal.Role of the Bcl-2 gene after contusive spinal cord injury in mice［J］.Neurosurgery，2003，53（1）:192-198.

［4］Kumar A，Singh TD，Singh SK，etal.Methods，potentials，and limitations of gene delivery to regenerate central nervoussystem cells［J］.Biologics，2009，3（2）:245-256..

［5］Chen DF，Schneider GE，Martinou JC，et al.Bcl-2 promotes regeneration of severed axons inmammalian CNS［J］. Nature，1997，385（6615）:434-439.

［6］Takahashi K，Schwarz E，Ljubetic C，et al.DNA plasmid that codes for human Bcl-2 gene preserves axotomized Clarke’s nucleus neurons and reduces atrophy after spinal cord hemisection in adult rats［J］.JComp Neurol，1999，404（2）：159-171.

［7］Shimazaki K，Urabe M，Monahan J，etal.Adeno-associated virus vector-mediated Bcl-2 gene transfer into post-ischemic gerbil brain in vivo:prospects for gene therapy of ischemia-induced neuronaldeath［J］.Gene Ther，2000，7（14）：1244-1249.

［8］Zhao H，Yenari MA，Cheng D，et al.Bcl-2 overexpression protects against neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome translocation and caspase-3 activity［J］.JNeurochem，2003，85（9）：1026-1036.

［9］Yamashita S，Mita S，Kato S，et al.Bcl-2 expression using retrograde transport of adenoviral vectors inhibits cytochrome c-release and caspase-1 activation in motor neurons ofmutant superoxide dismutase 1（G93A）transgenic mice［J］.Neurosci Lett，2003，350（1）：17-20.

［10］Yukawa Y，Lou J，F(xiàn)ukui N，et al.Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo［J］.JNeurotrauma，2002，19（8）：1091.

Inhibiting Role of Bcl-2 Gene in the Apoptosis of Nerve Cells

HAN Guihe，WEIWei，GU Jun，et al. Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou(310003)，China

Objective:To observe the inhibiting role of the proto-oncogene bcl-2 in the apoptosis of nerve cells. M ethods:PC12 cells were cultured to the logarithmic growth phase and then slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene and slow virus plasmid infected PC12 cells by 100 multiplicity of infection,respectively.The PC12 cells infected were then divided into 4 groups.Group A：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene；group B：PC12 cells with slow virus plasmid；group C：PC12 cells with slow virus plasmid carrying the bcl-2 gene，which were damaged by H2O2；group D：PC12 cells with slow virus plasmid，which were damaged by H2O2.The rate of apoptosis was detected by flow cytometry.The proteinum concentration of bcl-2 gene expression was detected by using bicinchoninic acid method.Results:The apoptosis rate of group A was lower than that of group B and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group A was higher than that of group B，both of which were significantly different between the 2 groups（P＜0.05）.The apoptosis rate of group C was lower than that of group D and the protein concentration of bcl-2 gene expression of group C was higher than that of group D，both of which significantly differed between the 2 groups（P＜0.05）.Conclusion:Bcl-2 gene can inhibit apoptosis of normal nerve cells and can enhance resistance ability of nerve cell to be damaged.

bcl-2 gene nerve cells apoptosis

2012-11-19

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃（No.20100733Q22）