葛根素對腦缺血大鼠腦組織MMP-9表達(dá)和腦水腫的影響

封 菲 洪鳴鳴 高 越 杭州市第一人民醫(yī)院老年科 杭州310003

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，能夠降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)。已有研究［1］，證實腦缺血再灌注后MMP-9 表達(dá)增多，并通過降解基底膜和連接蛋白而破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），導(dǎo)致血管源性腦水腫。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類化合物，有研究［2］證實，葛根素具有擴(kuò)張腦血管，改善微循環(huán)，抗血小板聚集，從而降低血液黏滯度以及抗氧自由基等多重途徑起到腦保護(hù)的作用。本研究擬通過觀察葛根素對大鼠腦缺血再灌注后是否能抑制MMP-9的表達(dá)，減輕血腦屏障的破壞和腦水腫，探討葛根素腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備及處理 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠54只，體質(zhì)量250～300g，清潔度Ⅱ級，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，隨機(jī)分為假手術(shù)組、對照組和藥物組，每組18只，各組再平均分為三個亞組，分別用于血腦屏障通透性測定、腦含水量測定及免疫組化。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，按照Bederson 等［3］的方法制作大鼠腦缺血再灌注模型，手術(shù)前后大鼠肛溫維持在（37±0.5）℃。缺血90min 后抽提栓線至頸外動脈殘端內(nèi)進(jìn)行再灌注。藥物組于缺血前1h 給予葛根素注射液（劑量70mg/kg）腹腔內(nèi)注射，隨后每間隔8h 再次注射，對照組及假手術(shù)組給予等量生理鹽水。

1.2 試劑和儀器 葛根素注射液（浙江康恩貝制藥公司）、伊文思藍(lán)（Evan's blue，EB）溶液（sigma 公司）、兔抗大鼠MMP-9 多克隆抗體、SABC 試劑盒及DAB 顯色劑（武漢博士德生物公司）、Olympus-CH2顯微鏡（日本歐林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會社）

1.3 BBB 通透性測定 大鼠處死前2h，尾靜脈注入2%EB 2mL/kg。再灌注48h時，用1%肝素生理鹽水經(jīng)心室灌流，然后迅速取損傷側(cè)腦組織，稱取濕重后置入加有5mL 甲酰胺的試管中，54℃恒溫培養(yǎng)箱孵育24h，讓組織中的EB 充分溶解在甲酰胺溶液中。將溶有EB的甲酰胺溶液過濾，用分光光度計（波長632nm）測各管吸光度（A）值，并制作EB標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性回歸方程，根據(jù)此線性回歸方程計算溶液中EB濃度，以每克腦組織濕重所含EB的微克數(shù)（μg/g）表示BBB通透性。

1.4 腦組織含水率測定 采用干濕稱重法。大鼠快速斷頭取腦，取右側(cè)大腦半球用電子天平獲取濕重，置入100攝氏度恒溫干燥箱內(nèi)48h再獲取干重，腦組織含水率計算公式：（濕重-干重）/濕重×100%

1.5 腦組織MMP-9 表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測。大鼠腦缺血再灌注48h時以4%多聚甲醛液約200mL經(jīng)心臟灌注固定，快速斷頭冰盤上取腦，視交叉和其后4mm 處兩點冠狀切片，片厚4mm，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、用切片機(jī)連續(xù)5mm 厚冠狀切片。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、煮沸法修復(fù)，過氧化氫阻斷，滴加兔抗大鼠MMP-9 多克隆抗體（工作濃度1：100），根據(jù)SABC試劑盒說明書對切片標(biāo)本進(jìn)行操作，予DAB 顯色，自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，脫水、封片，表達(dá)MMP-9 處在光鏡下為棕黃色物質(zhì)。每張切片先在低倍鏡下觀察，在腦梗死皮質(zhì)缺血區(qū)的位置隨機(jī)采集5個不重疊的高倍視野（×400），計數(shù)每張切片的總陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織EB 含量和含水率比較 對照組及藥物組大鼠腦組織EB 含量及含水率較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05）；與對照組比較，藥物組腦組織EB含量及含水率明顯減少（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠腦組織EB含量及腦組織含水率比較（）

表1 各組大鼠腦組織EB含量及腦組織含水率比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05

2.2 各組大鼠腦組織MMP-9 表達(dá) 三組大鼠的左側(cè)（未缺血側(cè)）大腦半球基本未見陽性細(xì)胞（每張切片的5個高部視野下MMP-9 總陽性細(xì)胞數(shù)為1.33±1.20），而對照組和藥物組大鼠的右側(cè)大腦半球皮質(zhì)缺血區(qū)均可見胞漿呈棕黃色的MMP-9 陽性細(xì)胞表達(dá)。藥物組MMP-9 陽性細(xì)胞數(shù)（33.50±2.17），較對照組（38.17±3.13）明顯減少（P＜0.05）。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是臨床上腦外傷、腦腫瘤、腦血管病等許多疾病伴發(fā)的常見病理損害過程，腦缺血再灌注損傷后的直接結(jié)果是形成腦水腫，而血管源性水腫是腦水腫的始動因素，在腦組織含水量和顱內(nèi)壓變化中起著關(guān)鍵作用，也是針對腦水腫采取干預(yù)措施的主要對象。

MMPs是參與組織重塑的鋅依賴的內(nèi)肽酶，正常時以酶原形式存在，在細(xì)胞外激活，MMPs 可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白包括血腦屏障的神經(jīng)血管基底膜和緊密連接蛋白因而成為研究熱點［4］。它的調(diào)節(jié)是復(fù)雜和嚴(yán)格的過程，其調(diào)節(jié)失控與創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中及神經(jīng)變性時血腦屏障破壞和突觸丟失相關(guān)［5-8］。MMP-9 基因缺失小鼠在腦外傷及卒中［9-10］的對照試驗中均出現(xiàn)水腫和炎癥反應(yīng)的減輕及腦白質(zhì)完整性和神經(jīng)功能的改善。一系列應(yīng)用MMP 抑制劑的實驗也證實可減輕腦水腫和腦梗死。但也有研究證實MMP具有雙相作用［11］。它在腦外傷和卒中后康復(fù)階段的神經(jīng)再生、神經(jīng)血管重塑中起重要作用［11-12］。

Rosenberg 等［13］發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷后24h MMP-9開始有表達(dá)，48h后可在血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元中觀察到MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)。多項研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后MMP-9 表達(dá)高峰和BBB破壞及腦水腫高峰均在腦缺血再灌注后48h。

本實驗選取腦缺血再灌注后48h為時間點，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后大鼠缺血區(qū)周邊皮質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞中MMP-9表達(dá)顯著增多，血腦屏障通透性和腦組織含水率也顯著增加，表明MMP-9參與了腦缺血再灌注損傷；本實驗中藥物組大鼠缺血側(cè)腦組織內(nèi)的EB 含量和腦組織含水率也較對照組下降（P＜0.05），提示葛根素干預(yù)后腦缺血再灌注大鼠BBB破壞程度和腦水腫得到減輕；研究還發(fā)現(xiàn)葛根素干預(yù)可減少大鼠腦缺血再灌注48h 后MMP-9的表達(dá)，我們推測葛根素可能通過下調(diào)MMP-9表達(dá)，減輕BBB的破壞和腦水腫，從而在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮其保護(hù)作用。

葛根素在臨床上廣泛地應(yīng)用于缺血性腦血管病的治療。葛根素具有擴(kuò)張腦血管，改善微循環(huán)，降低血漿內(nèi)皮素，抗血小板聚集，抗氧自由基，緩解腦血管痙攣，阻斷局部缺血缺氧及細(xì)胞內(nèi)鈣超載的惡性連鎖反應(yīng)，抑制誘生型NO 合酶系統(tǒng)的激活，干預(yù)細(xì)胞凋亡等作用［2］。本研究表明，葛根素可能通過抑制MMP-9的活化和減輕血腦屏障通透性起到腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用。

［1］Rosenberg GA，Yang Y.Vasogenic edema due to tight junction disruption by matrix metalloproteinases in cerebral ischemia［J］.Neurosurg Focus，2007，22（5）：E4.

［2］潘洪平，楊嘉珍，莫祥蘭，等.葛根素注射液對急性腦缺血模型大鼠腦細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中國中藥雜志，2005，30（6）：457-459.

［3］Berderson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［4］Grossetete M，Phelps J，Arko L，et al.Elevation of matrix metalloproteinases 3 and 9 in cerebrospinal fluid and blood in patients with severe traumatic brain injury［J］.Neurosurg，2009，65（4）：702-708.

［5］Candelario-Jalil E，Yang Y，Rosenberg GA.Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemia［J］.Neuroscience，2009，158（3）：983-994.

［6］Ding JY，Kreipke CW，Schafer P，et al.Synapse loss regulated by matrix metalloproteinases in traumatic brain injury is associated with hypoxia inducible factor-1alpha expression［J］.Brain Res，2009，1268（5）：125-134.

［7］Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and their multiple roles in neurodegenerative diseases［J］.Lancet Neurol，2009，8（2）：205-216.

［8］Rosenberg GA，Yang Y.Vasogenic edema due to tight junction disruption by matrix metalloproteinases in cerebral ischemia［J］.Neurosurg Focus，2007，22（2）：E4.

［9］Asahi M，Wang X，Mori T，et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of bloodbrain barrier and white matter components after cerebral ischemia［J］.J Neurosci，2001，21（19）：7724-7732.

［10］Gidday JM，Gasche YG，Copin JC，et al.Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（2）：H558-H568.

［11］Zhao B-Q，Wang S，Kim H-Y，et al.Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke［J］.Nat Med，2006，12（4）：441-445.

［12］Falo MC，F(xiàn)illmore HL，Reeves TM，et al.Matrix metalloproteinase-3 expression profile differentiates adaptive and maladaptive synaptic plasticity induced by traumatic brain injury［J］.J Neurosci Res，2006，84（4）：768-781.

［13］Rosenberg GA，Cunningham LA，Wallace J，et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain activation of MMP-9 llinked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures［J］.Brain Res，2001，893（1～2）：104-112.