嗅味物質(zhì)對銅綠微囊藻的溶藻效應(yīng)

張可佳 ，高乃云，邵煜，李聰，張土喬，楊玉龍

(1. 浙江大學(xué) 建筑工程學(xué)院，浙江 杭州，310058；2. 同濟大學(xué) 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海，200092)

由于環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，許多水體富營養(yǎng)化而導(dǎo)致藍(lán)藻水華的暴發(fā)，成為我國目前及今后長時期內(nèi)的一項重大水環(huán)境問題?，F(xiàn)有的藻類控制技術(shù)如投加化學(xué)除藻劑等存在費用高、難操作、生態(tài)危害大等缺陷。因此，探索經(jīng)濟有效的水華防治方法對于改善水環(huán)境、保障飲用水安全具有重大意義。其中利用生物間的化感作用來抑制藻類生長具有高效、安全、易操作等優(yōu)點，是當(dāng)前研究的熱點之一[1]。所謂化感作用，即細(xì)胞產(chǎn)生自體毒性物質(zhì)，對同種其他個體或親緣種的生長產(chǎn)生抑制甚至破壞作用，從而有利于群體保持平衡[2]。如高濃度的微囊藻毒素 RR對水華束絲藻會產(chǎn)生急性致死效應(yīng)[3]，球等鞭金藻產(chǎn)生的十二烯酸異丙酯(HDMA)對自身藻細(xì)胞存在抑制效應(yīng)[4]等。目前已發(fā)現(xiàn)的藍(lán)藻分泌的抑制物質(zhì)主要有生物堿、脂肪酸、肽類、酮醇、萜類化合物等[5]。藍(lán)藻代謝的嗅味物質(zhì)多為萜類化合物和脂肪酸，如 2-MIB、β-環(huán)檸檬醛、β-羅蘭酮、庚醛等[6]；而有些嗅味物質(zhì)是非萜類化合物，如甲硫醚、二甲基三硫醚等。這些嗅味物質(zhì)除了是造成飲用水異嗅異味的主要來源[7]之外，其特殊的化學(xué)特性也可能影響藻類自身的生長代謝。在國內(nèi)外，具體哪些嗅味物質(zhì)對藍(lán)藻具有抑制效應(yīng)及抑制程度尚未進(jìn)行過系統(tǒng)研究。因此，本文作者考察不同的嗅味物質(zhì)對自身藻體的溶藻效應(yīng)，根據(jù)表觀分析和儀器測定找出對藍(lán)藻溶藻作用較大的嗅味物質(zhì)，并確定其導(dǎo)致溶藻的界限濃度，從而從機理上分析藍(lán)藻在自然環(huán)境中維持平衡的原因，為后續(xù)生物控藻技術(shù)的發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗藥劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、甲硫醚、二甲基三硫醚和庚醛為色譜純(純度＞90%)，購自Sigma(美國)、Aldrich(美國)、Fluka(日本)等公司。銅綠微囊藻藻種Microcystis aeruginosa (905)，購自中科院水生生物研究所，培養(yǎng)基為BG11，光照度為2 000 lux，光暗周期為12 h:12 h，培養(yǎng)溫度為25 ℃。實驗用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 試驗方法

待培養(yǎng)的銅綠微囊藻處于穩(wěn)定期，OD680為0.712，細(xì)胞密度為4.7×109L-1。分別取200 mL藻液到500 mL的玻璃三角錐瓶中，共6份，編號為0號、1號、2號、3號、4號和5號。用鋁箔紙蓋上瓶蓋，防止外部雜質(zhì)進(jìn)入；并在上面扎一些小孔，以保證藻液與外界空氣流通。其中 0號為空白樣品，1號、2號、3號、4號和5號分別加入200 μL的嗅味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、甲硫醚、二甲基三硫醚和庚醛，濃度為1 g/L。放置培養(yǎng)箱中(25 ℃恒溫)，分別于1，3，8，18，30和92 h，測定吸光度AOD680和光能利用率α。用0.45 μm的乙酸纖維濾膜過濾藻液，用HPLC測特定時刻濾液的微囊藻毒素 LR，即得到胞外藻毒素LR的濃度變化情況?？疾觳煌瑵舛鹊摩?環(huán)檸檬醛對銅綠微囊藻的影響時，配置β-環(huán)檸檬醛的初始濃度分別為1，0.5，0.2，0.1和0.01 g/L，在不同時間測光能利用率α。

1.3 分析設(shè)備和方法

調(diào)制葉綠素?zé)晒夥治鰞x(PHYTO-PAM，德國Walz公司)用于測定光能利用率 α(即細(xì)胞光合活性)，在室溫下進(jìn)行，暗適應(yīng)時間不少于10 min。分光光度計(美國哈希公司，DR/2010)在680 nm波長的吸光度可反映銅綠微囊藻的個數(shù)，其相關(guān)性較好，R2可達(dá)0.99以上。高效液相色譜儀(HPLC，型號：LC-2010A HT,，Shimadzu，日本)用于測定微囊藻毒素MC-LR的濃度。色譜柱為 BDS-C18反相色譜柱，其尺寸為 150 mm(長)×4.6 mm(內(nèi)徑)×5 mm(膜厚度)。流動相為甲醇和pH=3的磷酸緩沖溶液，比例為57:43；檢測波長為238 nm；柱溫40 ℃；分析時間為15 min；MC-LR的響應(yīng)時間為12.5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 對藻液顏色的影響

試驗向正常生長的銅綠微囊藻藻液中投加 1 g/L的不同嗅味物質(zhì)，觀察隨著時間的推移藻液顏色的變化情況，結(jié)果如圖1所示。藻液本身的顏色為綠色(由于含有葉綠素所致)，藻細(xì)胞分布均勻，沒有懸浮物和沉淀。經(jīng)過1 h后，1號瓶中的藻液變成了藍(lán)色，隨著時間的延長，顏色越來越淺，到第8 h后，已經(jīng)變成乳白色，并有懸浮物。而2號瓶的顏色自第8 h開始，由原來的綠色逐漸變成了黃綠色。4號瓶和5號瓶自第18 h開始，綠色也越來越淺，在第30 h后逐漸轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，甚至乳白色(5號瓶，92 h時)。對于3號瓶，在整個試驗過程中，同空白樣品一樣，顏色沒有明顯地變化，仍是綠色。藻液的顏色之所以發(fā)生變化，主要是由于藻細(xì)胞受到破壞后，胞內(nèi)的藻藍(lán)蛋白，溶解到水中造成的[8]。這與在實際水環(huán)境中，藍(lán)藻衰亡時水體顏色變化特征一致。表明水體由綠色變?yōu)樗{(lán)色與水體中的嗅味物質(zhì)積累到一定程度有關(guān)。Ozaki等[9]曾在研究中提到β-環(huán)檸檬醛是唯一引起藻液顏色變化的揮發(fā)性物質(zhì)，但試驗的時間僅有7 h，無法觀測到其他嗅味物質(zhì)的作用效果。在本研究中，通過對藻液顏色的觀察，可以發(fā)現(xiàn)嗅味物質(zhì)會不同程度地引起藻液顏色變化，對銅綠微囊藻細(xì)胞的影響從大到小依次是：β-環(huán)檸檬醛，β-紫羅蘭酮，庚醛，二甲基三硫醚，甲硫醚。由此可見：萜類化合物和脂肪酸對藻細(xì)胞的破壞作用較大，而含硫化合物的抑制活性較小。

2.2 對藻細(xì)胞光合活性的影響

圖1 嗅味物質(zhì)改變藻液的顏色Fig. 1 Color variance in Microcystis aeruginosa by odorants

試驗采用吸光度AOD680來反映藻細(xì)胞的數(shù)量，利用PAM儀器所測得的光能利用效率α來反映細(xì)胞的光合活性。圖2所示為AOD680隨時間的變化。從圖2可以看出：在第1 h內(nèi)，β-環(huán)檸檬醛作用下的藻液的AOD680降到0.45左右，并保持穩(wěn)定，說明有些細(xì)胞已經(jīng)不是完整的球形了。Ozaki等[10]加入6.5 mmol/L的β-環(huán)檸檬醛作用1 h后，經(jīng)過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞光滑的表面開始起皺，變得凹凸不平。圖3所示為光合活性a隨時間的關(guān)系。由圖3可見：在β-環(huán)檸檬醛作用下，光合活性a直接由0.46降到了0，說明此時的藻細(xì)胞已經(jīng)失去了光合活性。同理，在β-紫羅蘭酮、庚醛、二甲基三硫醚的作用下，藻液的光合活性a也都有不同程度地降低，其影響的大小順序與上節(jié)討論相同。對于甲硫醚作用的藻液，細(xì)胞數(shù)量沒有明顯的降低，同時其光合活性的變化與空白樣品相似。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，β-環(huán)檸檬醛的破壞作用最大，溶藻速度最快。

β-環(huán)檸檬醛等萜類化合物之所以能影響藻細(xì)胞的變化，主要是因為一方面它們屬于細(xì)胞溶解酶，能溶解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，造成細(xì)胞個體較大程度地收縮，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；另一方面，它會阻礙細(xì)胞中RNA的傳遞或破壞 DNA的結(jié)構(gòu)，通過對遺傳基因造成負(fù)影響而阻礙細(xì)胞的進(jìn)一步分裂[9]。而對于非萜類化合物的二甲基三硫醚對細(xì)胞的破壞作用，主要是由于酸壓力，高濃度的溶液對細(xì)胞造成了高滲透壓，胞外的水分經(jīng)過滲透作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，造成細(xì)胞體積膨脹，破裂致死。對于甲硫醚，在該濃度下的滲透壓不是足夠大，因此對細(xì)胞結(jié)構(gòu)不造成明顯影響，不會破壞細(xì)胞的光合活性。

圖2 AOD680隨時間的變化Fig. 2 Variation of AOD680 with time

圖3 光合活性a隨時間的變化Fig. 3 Variations of photosynthetic activity with time

2.3 對藻細(xì)胞釋放代謝物的影響

在正常的新陳代謝過程中，藻細(xì)胞會以2種方式釋放胞內(nèi)的代謝物：一是通過膜內(nèi)外的濃度平衡，擴散到溶液中，一般是相對分子質(zhì)量較小的糖醇、氨基酸等；二是細(xì)胞表面的不可逆降解，即當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞后，胞內(nèi)的代謝物會穿過裂口進(jìn)入到水體[11]，如藻藍(lán)蛋白和藻毒素等。微囊藻毒素LR(MC-LR)是銅綠微囊藻代謝和分泌的主要毒素之一[12]，在藍(lán)藻水體污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)量最大、造成危害最嚴(yán)重。本研究考察了藻細(xì)胞中 MC-LR釋放的情況，以探討胞內(nèi)分泌物受嗅味物質(zhì)的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見：空白水樣的胞外藻毒素 MC-LR維持在 230 μg/L左右。甲硫醚投加后，胞外MC-LR的質(zhì)量濃度沒有明顯變化，說明甲硫醚對細(xì)胞沒有造成額外的破壞作用。其他嗅味物質(zhì)存在的條件下，胞外的MC-LR都隨著時間延長有所增加。盡管β-紫羅蘭酮較庚醛更早地使藻液變色，但從 MC-LR的釋放程度來看，加入它們對藻細(xì)胞的破壞程度相似，最大質(zhì)量濃度分別為524.10和727.33 μg/L。因此可認(rèn)為利用胞外MC-LR的濃度變化來判斷藻細(xì)胞的破壞程度較直接通過肉眼觀察藻液顏色變化更為合理和準(zhǔn)確。β-環(huán)檸檬醛對細(xì)胞的破壞作用最大，當(dāng)?shù)?2 h后，質(zhì)量濃度達(dá)到了2 628.3 μg/L，是正常情況下的10倍以上。

圖4 微囊藻毒素-LR質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig. 4 Variations of concentration of MC-LR with time

2.4 β-環(huán)檸檬醛的初始濃度的影響

針對β-環(huán)檸檬醛對銅綠微囊藻的溶藻效應(yīng)最為明顯，考察不同初始質(zhì)量濃度的β-環(huán)檸檬醛的影響大小，從而確定β-環(huán)檸檬醛能產(chǎn)生抑制作用的臨界濃度。β-環(huán)檸檬醛的初始質(zhì)量濃度分別為 0.01，0.1，0.2，0.5和1 g/L，其光合活性a的變化如圖5所示。由圖5可見：隨著β-環(huán)檸檬醛質(zhì)量濃度的增大，光合活性a衰減得越快。當(dāng)β-環(huán)檸檬醛的初始質(zhì)量濃度為1 g/L時，0.5 h內(nèi)的光合活性a已由0.46降為0；當(dāng)初始質(zhì)量濃度依次降低為0.5，0.2和0.1 g/L時，其完全失去光合活性的時間分別為1，2和4 h。當(dāng)初始質(zhì)量濃度為0.01 g/L時，其光合活性的變化趨勢與銅綠微囊藻正常生長狀態(tài)下相近，說明此濃度下的β-環(huán)檸檬醛不會對藻細(xì)胞產(chǎn)生溶藻效應(yīng)，因此對銅綠微囊藻起到抑制作用的臨界質(zhì)量濃度可確定為 0.1 g/L，低于該濃度的 β-環(huán)檸檬醛不易對藻細(xì)胞的生長造成影響。通過對臨界質(zhì)量濃度的確定，可以明確提前打撈藍(lán)藻的數(shù)量，再對其進(jìn)行物理破壞，待產(chǎn)生大量嗅味物質(zhì)后重新投入藍(lán)藻暴發(fā)的水體，利用其對同類藻細(xì)胞的化感作用，對處于對數(shù)生長期的藻體進(jìn)行控制，以達(dá)到生物除藻的目的。

圖5 β-環(huán)檸檬醛的初始質(zhì)量濃度對光合活性a的影響Fig. 5 Effects of initial concentration of β-cyclocitral to photosynthetic activity

3 結(jié)論

以藻類分泌的嗅味物質(zhì)為代表，考察其對銅綠微囊藻的溶藻效應(yīng)。自體嗅味物質(zhì)β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、庚醛和二甲基三硫醚對藻細(xì)胞均有不同程度地抑制和破壞作用，能降低藻細(xì)胞的光合活性，使細(xì)胞破裂，釋放胞內(nèi)的代謝物。甲硫醚對銅綠微囊藻的溶藻效應(yīng)不明顯，對藻細(xì)胞完整性的破壞能力較小。β-環(huán)檸檬醛對銅綠微囊藻表現(xiàn)為急劇毒性，1 g/L的質(zhì)量濃度下能在1 h內(nèi)迅速溶解細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，將胞內(nèi)的 MC-LR大量釋放，使藻液由綠色變成藍(lán)色，光合活性降為0。不同初始濃度的β-環(huán)檸檬醛對藻細(xì)胞的作用大小不同，0.1 g/L是起到抑制作用的臨界濃度。

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