海南尖峰嶺野生靈芝菌種培養(yǎng)基配方篩選*

陳 友 胡佳娟 陳勇敢

（1.瓊州學(xué)院，海南 三亞 572022；2.三亞市第二中學(xué)，海南 三亞 572000）

海南尖峰嶺野生靈芝菌種培養(yǎng)基配方篩選*

陳 友1胡佳娟2陳勇敢1

（1.瓊州學(xué)院，海南 三亞 572022；2.三亞市第二中學(xué)，海南 三亞 572000）

以瓊州學(xué)院靈芝栽培培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，對(duì)海南尖峰嶺兩種野生靈芝的一、二、三級(jí)菌種的培養(yǎng)基配方進(jìn)行篩選試驗(yàn)結(jié)果，一級(jí)種較優(yōu)培養(yǎng)基為PDA+1/4MS（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、1/4MS培養(yǎng)液、20 mL的1/4MS培養(yǎng)基）；二級(jí)種的較優(yōu)培養(yǎng)基為Y1005（木屑78％、麥麩或米糠20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量50％～60％），三級(jí)種的較優(yōu)培養(yǎng)基為Y3102（木屑73％、黃豆粉5％、麥麩20％、蔗糖1％、石膏1％，含水量60％～65％）。

海南；野生靈芝；培養(yǎng)基；配方；篩選

靈芝（Ganoderma lucidum）[1]素有“仙草”、“瑞草”之稱，古今藥理與臨床研究均證明其有防病治病、延年益壽的功效。

靈芝屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬[2]，主要生長(zhǎng)在雨林、山坡草地和海濱紅樹林中腐朽的樹干、樹根或木樁上[3]。我國地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣[2]，計(jì)有78種，分屬4屬、3亞屬、2個(gè)組[4]，以海南島分布種類最多，占全國靈芝科的53.6％[2]。

靈芝豐富的生物活性成分決定了其功能的多樣性[5]。目前已分離到靈芝的150余種活性成分，有多糖類、核苷類、生物堿類、氨基酸、蛋白質(zhì)類、三萜類和礦質(zhì)元素[6]等。其中，靈芝多糖能提高機(jī)體免疫力、刺激干擾素的形成，同時(shí)能提高機(jī)體抗病毒、抗氧化、抗腫瘤[7]、耐缺氧等多方面的功能[8]，還能有效地促進(jìn)肝臟、骨髓、血液中DNA 、RNA和蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到益壽延年的功效[9]；靈芝中所含有的纖維素可在大腸中脫水，能有效地防止便秘，還可降低膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等；從靈芝粗脂肪中分離出的三萜類物質(zhì)，具有止痛、鎮(zhèn)靜、解毒、保肝、抑制組織胺釋放、毒殺腫瘤細(xì)胞等多種功效，而其藥理藥效對(duì)人體無任何副作用[10]。

野生靈芝品種的馴化研究是資源利用中不可或缺的一環(huán)。筆者選擇海南尖峰嶺不同原生境的兩種野生靈芝作為材料，以瓊州學(xué)院靈芝培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，優(yōu)化一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)菌種的培養(yǎng)基配方，用以培育優(yōu)良菌種，供后期人工栽培。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料是兩株生長(zhǎng)于海南省尖峰嶺地區(qū)不同原生境的野生靈芝。將黃邊靈芝（Ganoderma luteomarhinatum）編號(hào)4-3，咖啡網(wǎng)孢芝（Humphreya coffeatum)編號(hào)4-5。

1.2 試驗(yàn)方法 培養(yǎng)基供試配方見表1。

（1）一級(jí)種（母種）培養(yǎng)。以配制100 mLPDA培養(yǎng)基為例說明。首先按配方稱量各種原料的1/10，加水適量，加熱后濾液，加水至100 mL。加瓊脂煮溶，補(bǔ)水至100 mL的濾液置于250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，于121 ℃下滅菌20 min。然后，將滅好菌的培養(yǎng)基分成9個(gè)平板，貼標(biāo)簽。其他3種培養(yǎng)基中1/2MS、1/4MS和1/10MS培養(yǎng)基是由標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基分別稀釋至2倍、4倍和10倍后加入。

表1 靈芝一、二、三級(jí)菌種的培養(yǎng)基試驗(yàn)配方

過夜待平板內(nèi)水分被培養(yǎng)基完全吸收后，分別接入兩種靈芝菌種，每個(gè)菌種每種培養(yǎng)基接3個(gè)平板，并做好標(biāo)記。用保鮮膜將平板封緊，背面以所接菌種為原點(diǎn)，畫兩條相互垂直的線，記作A、B，每?jī)商煊涗浺淮胃髌桨錋、B線上菌絲圈的直徑大小，累計(jì)7次，歷時(shí)14天。通過數(shù)據(jù)的相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，確定兩種靈芝各自最佳的生長(zhǎng)配方。最后以最佳者為一級(jí)種接種到二級(jí)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）二級(jí)種的培養(yǎng)。根據(jù)配方配制所需培養(yǎng)基。以Y1004為例，首先按比例稱取各原料并攪拌均勻，邊攪拌邊加水，含水量約60％，以手用力抓料，指縫中無水滴出但松手后手掌濕潤(rùn)為宜。培養(yǎng)料裝瓶（15瓶）后，貼上標(biāo)簽，將料瓶及其他用具于121 ℃下滅菌120 min后，及時(shí)轉(zhuǎn)移至接種室，待溫度降至室溫后進(jìn)行接種并在標(biāo)簽紙上注明所接菌種的編號(hào)及接種日期。

將培養(yǎng)瓶置于25 ℃下培養(yǎng)并適時(shí)記錄菌絲的生長(zhǎng)高度。滿瓶后，分別以時(shí)間、高度、長(zhǎng)勢(shì)為依據(jù)計(jì)算、分析、比較各靈芝菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度，取最佳者作為二級(jí)種接種到三級(jí)培養(yǎng)基上。

（3）三級(jí)種的培養(yǎng)。三級(jí)種采用栽培袋培養(yǎng)，試驗(yàn)步驟與二級(jí)種基本相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)靈芝一級(jí)種菌絲生長(zhǎng)的影響由表2、圖1可知，靈芝4-3號(hào)的一級(jí)種菌絲在培養(yǎng)基PDA+1/4MS上的生長(zhǎng)速度較快，長(zhǎng)勢(shì)較好；而靈芝4-5號(hào)菌絲在培養(yǎng)基PDA+1/2MS和PDA+1/4MS上生長(zhǎng)快，長(zhǎng)勢(shì)好。綜合4-3號(hào)和4-5號(hào)的一級(jí)種生長(zhǎng)情況，認(rèn)為PDA+1/4MS培養(yǎng)基為一級(jí)種的較優(yōu)培養(yǎng)基配方。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)靈芝二級(jí)種菌絲生長(zhǎng)的影響由表2可知，靈芝4-3、4-5的二級(jí)種在培養(yǎng)基Y1005上菌絲生長(zhǎng)速度快，密度大，為兩個(gè)菌種的二級(jí)種最佳培養(yǎng)基配方。所以，均以Y1005培養(yǎng)基上的菌落作為菌種接種到三級(jí)種培養(yǎng)基上。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)靈芝三級(jí)種菌絲生長(zhǎng)的影響由表2、圖2可知，靈芝4-3、4-5的三級(jí)種的菌絲均在培養(yǎng)基Y3102上生長(zhǎng)速度快，且菌絲濃密，長(zhǎng)勢(shì)良好；在培養(yǎng)基Y3101上菌絲前期長(zhǎng)勢(shì)良好，但后期生長(zhǎng)停滯并出現(xiàn)明顯的黃化現(xiàn)象。

表2 靈芝一、二、三級(jí)種在不同培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)情況

3 討 論

圖1 不同培養(yǎng)基中靈芝一級(jí)種菌絲生長(zhǎng)狀況

圖2 不同培養(yǎng)基中靈芝二級(jí)種菌絲生長(zhǎng)情況

3.1 試驗(yàn)中較適母種培養(yǎng)基配方是以PDA培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，加入MS母液進(jìn)行梯度篩選，結(jié)果靈芝4-3號(hào)、4-5號(hào)的一級(jí)種在培養(yǎng)基PDA+1/4MS上的生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)均很好。此配方既適合栽培種也適合野生種，可作為一級(jí)種培育的首選配方。試驗(yàn)中靈芝4-5號(hào)在培養(yǎng)基PDA+1/2MS上也具有較佳生長(zhǎng)速度，這說明野生靈芝不同品種的一級(jí)種配方還存在進(jìn)一步優(yōu)化的空間。

3.2 兩個(gè)野生靈芝菌株二級(jí)種在Y1005培養(yǎng)基上均具有較佳長(zhǎng)勢(shì)。4種培養(yǎng)基配方均以木屑為主料，試驗(yàn)結(jié)果差異主要在于輔料。所有的植物組織培養(yǎng)基都需要有碳水化合物作為能源，蔗糖作為組織培養(yǎng)的碳源則具有普遍性和廣泛性。兩個(gè)菌株在Y1005麥麩培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度快、菌絲濃密，而在Y1004玉米粉培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)速較慢、長(zhǎng)勢(shì)較差。分析原因是麥麩顆粒較松散，培養(yǎng)料內(nèi)氧氣量充足，較適宜菌絲生長(zhǎng)；而玉米粉顆粒間空隙小，菌種培養(yǎng)過程放置時(shí)間長(zhǎng)易吐黃水，不利于菌絲生長(zhǎng)。Y1005、Y1006的差異還在于Ca2+的存在形式，試驗(yàn)表明石膏中的Ca2+較過磷酸鈣更利于靈芝吸收，且更經(jīng)濟(jì)，更具有可取性。

3.3 研究表明，主料中添加麥麩等含氮量高的輔料會(huì)明顯提高靈芝產(chǎn)量，添加量為20％時(shí)產(chǎn)量較高[11]。兩個(gè)靈芝菌株三級(jí)種在Y3102黃豆粉培養(yǎng)基上較Y3101玉米粉培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度快，菌絲濃密，這主要與黃豆粉較松散，利于菌絲生長(zhǎng)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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農(nóng)業(yè)部熱帶種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目《香蕉種質(zhì)資源調(diào)查與收集》（12RZZY-47）；瓊州學(xué)院青年教師科研基金項(xiàng)目《海南野生香蕉馴化研究》（No.QY200917）；三亞市院校專項(xiàng)資金項(xiàng)目《海南野生靈芝馴化研究》（No.YD09041）。

陳友(1975-)，男，講師，主要從事香蕉種質(zhì)資源多樣性及遺傳關(guān)系研究，E-mail:342389998@qq.com。