蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

胡仁統(tǒng)，張學(xué)榮，徐 瑾，羅小玲，林 興，廖 明

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心、2.附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧 530021)

多年來(lái)對(duì)肝纖維化的研究越來(lái)越深入，但是缺乏理想的治療方案。目前針對(duì)肝纖維化的藥物治療主要還是在離體和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中顯示具有一定的療效，其中包括作用于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和細(xì)胞因子的藥物［1］、抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的藥物如干擾素［2］及抗氧化劑［3］等。但讓眾多研究者困惑的是幾乎所有的抗肝纖維化藥物在離體細(xì)胞以及動(dòng)物模型中具有一定的效果而在臨床上無(wú)效或效果比較差，這導(dǎo)致了這些抗肝纖維化藥物很難在臨床應(yīng)用與治療。因?yàn)楦卫w維化的發(fā)生發(fā)展是一種多途徑、多因素參與的過(guò)程，主要病理改變是ECM的過(guò)度合成與異常沉積。HSC是參與肝纖維化的最重要細(xì)胞，HSC的活化、增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，而抑制HSC增殖、誘導(dǎo)其凋亡成為抗肝纖維化的重要策略［4］。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的典型代表［5］，其在神經(jīng)領(lǐng)域的應(yīng)用已被公認(rèn)。近年來(lái)NGF誘導(dǎo)HSC細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。眼鏡蛇毒中富含NGF，而且分離純化NGF不僅得率較高，還具有耐堿、耐酸、耐蛋白酶水解及穩(wěn)定性高等的特點(diǎn)，廣西是眼鏡蛇的主要產(chǎn)地，充分開(kāi)發(fā)這一資源具有重要的研究意義。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的方法，在細(xì)胞水平探討NGF對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖、凋亡作用以及細(xì)胞中與肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，為進(jìn)一步揭示肝纖維化的發(fā)展機(jī)制及NGF抗肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器眼鏡蛇蛇毒NGF由廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供;大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6購(gòu)于湖南湘雅醫(yī)學(xué)院;大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC-12)購(gòu)于上海中科院細(xì)胞研究所;胎牛血清、馬血清、F12培養(yǎng)基、MTT購(gòu)自Sigma公司;高糖DMED培養(yǎng)基購(gòu)自HYCLONE公司;PC-12細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清+5%馬血清+1%的雙抗的F12K培養(yǎng)液;HSC-T6細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清+1%雙抗的高糖DMED培養(yǎng)液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)。雙向電泳所用試劑主要購(gòu)自Promega公司，17 cm固相pH梯度(IPG)干膠條(pH 3～10)、IPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)、Ettan DALT Six垂直電泳儀、高分辨的圖像掃描儀和凝膠斑點(diǎn)采集儀(Picker)購(gòu)于BIO-RAD公司。所有試劑以去離子水配置。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1眼鏡蛇毒NGF活性鑒定 將生長(zhǎng)良好的PC-12細(xì)胞以每毫升5×105個(gè)細(xì)胞的濃度接種于24孔板。待細(xì)胞貼壁后吸掉培養(yǎng)基，加入眼鏡蛇NGF，并換用低濃度血清培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)為2%馬血清+5%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液)進(jìn)行培養(yǎng)，使NGF終濃度為2 mg·L－1，培養(yǎng)時(shí)間為2～4 d，其間在普通顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2MTT法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的增值 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的高糖DMED培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升2×105個(gè)，接種于96孔板。待培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁后，加入 NGF。以不同濃度 NGF(1、2、5、10、20 mg·L－1)分組，同時(shí)設(shè)置未加任何藥物的空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。作用24 h后，每孔加5 000 mg·L－1的 MTT 貯存液 20 μl，孵育 4 h，棄上清并每孔再加150 μl DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，振蕩器上振蕩10 min，孵育10 min，酶標(biāo)儀595 nm處測(cè)各孔吸光度。

1.2.3流式細(xì)胞儀觀察和測(cè)定HSC-T6細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白對(duì)照組和NGF干預(yù)組，NGF濃度根據(jù)MTT結(jié)果選2、5 mg·L－1的NGF濃度進(jìn)流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HSC-T6細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 ml，培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁，吸掉培養(yǎng)基，用體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的高糖DMED培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加入NGF，在培養(yǎng)箱孵育24 h，胰酶消化離心收集細(xì)胞。用體積分?jǐn)?shù)為2%BSA的PBS洗細(xì)胞兩次，加入300 μl流式上樣緩沖液、5 μl FITC 和 5 μl PI，均勻混合，避光反應(yīng)5～15 min。0.5 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4雙向凝膠電泳細(xì)胞總蛋白的提取 取生長(zhǎng)良好的HSC-T6細(xì)胞于25 ml培養(yǎng)瓶里進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的60% ～70%開(kāi)始藥物作用，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和NGF藥物作用組，NGF藥物濃度根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果以半數(shù)抑制率對(duì)應(yīng)的藥物濃度，用體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清的高糖DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物作用24 h后分別提取細(xì)胞總蛋白，同時(shí)每個(gè)組做3次平行實(shí)驗(yàn)。提取出來(lái)的細(xì)胞總蛋白用3 ku的超濾管進(jìn)行超濾以除鹽，然后用考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE電泳分析細(xì)胞總蛋白，并把蛋白質(zhì)等質(zhì)量分裝真空凍干機(jī)凍干備用。

1.2.5雙向凝膠電泳 使用17 cm IPG膠條(非線性)進(jìn)行等電聚焦電泳，應(yīng)用膠內(nèi)泡脹法進(jìn)行加樣，蛋白上樣量為500 μg左右。采用低電壓50 V，12 h主動(dòng)水化。等電聚焦步驟如下:500 V 1 h、1 000 V 1 h、10 000 V 5 h，待17 cm膠條等電聚焦總伏時(shí)達(dá)到60 000 V時(shí)結(jié)束聚焦。將膠條取出，在平衡液中進(jìn)行兩步平衡，平衡后將膠條轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠后進(jìn)行第二向電泳，電泳條件為每塊膠恒定電流10 mA，20 min后將電流加大到30 mA，待溴酚藍(lán)指示帶到達(dá)凝膠底部處結(jié)束電泳。

1.2.6銀染及圖像分析 SDS-PAGE凝膠使用固定液固定2 h以上，敏化液敏化30 min，用蒸餾水漂洗3次，每次15 min，然后銀染20 min，倒掉銀染液用蒸餾水漂洗2次，每次1 min，馬上加入顯色液晃動(dòng)直到看到明顯的蛋白點(diǎn)，立刻用終止液進(jìn)行終止反應(yīng)，最后用蒸餾水保存。然后通過(guò)GS-800凝膠掃描儀獲得數(shù)字化圖像，并用PD Quest 7.3軟件進(jìn)行分析。

1.2.7差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定 對(duì)表達(dá)差異在2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上用槍頭挖出來(lái)，然后進(jìn)行膠內(nèi)酶解，把酶解出來(lái)的蛋白質(zhì)多肽用Zip Tip脫鹽柱脫鹽，濃縮后與基質(zhì)1∶1比例混合，點(diǎn)在點(diǎn)板儀上，自然晾干后MALDI-TOF/TOF-MS檢測(cè)，鑒定差異蛋白質(zhì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間差異用t檢驗(yàn)，以±s表示。圖譜分析由STATA 7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件(State Corp，College Station，TX，USA)完成。

2 結(jié)果

2.1NGF性質(zhì)鑒定在空白對(duì)照組中PC12細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，也有部分呈不規(guī)則形，無(wú)明顯突起。而NGF實(shí)驗(yàn)組，可見(jiàn)PC12細(xì)胞長(zhǎng)出多個(gè)神經(jīng)纖維樣的突觸，突觸數(shù)目不等，長(zhǎng)短不一，有些交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞的分化程度與NGF呈時(shí)間依賴性，見(jiàn)Fig 1。結(jié)果表明，NGF能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化，并具有良好的生物學(xué)活性。

2.2NGF對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響將不同濃度的NGF干預(yù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HSC-T6，MTT結(jié)果顯示，與空白對(duì)照比較，NGF各劑量組均不同程度地抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，NGF濃度為1 mg·L－1時(shí)抑制率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5 mg·L－1差異效果變得比較明顯(P＜0.01)，抑制率先隨著NGF濃度的增加而變大，然后又開(kāi)始減小，見(jiàn)Tab 1，說(shuō)明NGF在一定濃度范圍內(nèi)具有抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的作用。

Fig 1 Analysis of the activity of PC-12 cells treated with cobra venom NGF

Fig 2 HSC-T6 cells after the cobra venom NGF is added(detected by flow cytometry)

Tab 1 Effect of NGF on the proliferation of HSC-T6(±s)

Tab 1 Effect of NGF on the proliferation of HSC-T6(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·L－1The rata of inhibition/%Control group 0 23.8 ±1.8 NGF 1 25.1 ±2.1*2 38.5 ±2.0＊＊5 48.2 ±1.9＊＊10 67.8 ±2.3＊＊20 56.7 ±2.5＊＊

2.3NGF對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組有少數(shù)細(xì)胞凋亡，而NGF干預(yù)組作用24 h后檢測(cè)不同濃度組均存在不同程度的凋亡。其中NGF濃度為2 mg·L－1時(shí)凋亡率(16.16% ±3.02%)，與空白對(duì)照組凋亡率(2.70%±1.55%)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);當(dāng) NGF濃度升到 5 mg·L－1時(shí)，凋亡率為21.15%±3.31%，與對(duì)照組凋亡率比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，并且凋亡效果更加明顯，說(shuō)明NGF可誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞發(fā)生凋亡，見(jiàn)Fig 2。

2.4細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE電泳圖SDS-PAGE電泳顯示空白對(duì)照組和NGF作用組細(xì)胞總蛋白的條帶非常多，分子量大小不一，看不出明顯的差異條帶，見(jiàn) Fig 3。

2.5HSC-T6細(xì)胞的2-DE圖譜的建立及差異分析對(duì)空白對(duì)照組和NGF作用的實(shí)驗(yàn)組HSC-T6細(xì)胞總蛋白進(jìn)行雙向電泳，獲得2張電泳圖譜，空白對(duì)照的HSC-T6細(xì)胞和NGF作用的HSC-T6細(xì)胞的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為(668±28)個(gè)和(607±23)個(gè)，兩組之間的匹配率為90.9%。利用圖像分析軟件對(duì)蛋白圖譜進(jìn)行差異分析篩選出差異表達(dá)的蛋白47個(gè)，其中在NGF作用HSC-T6中表達(dá)上調(diào)的25個(gè)，下調(diào)的22個(gè)。其中NGF組中箭頭標(biāo)注為部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，見(jiàn)Fig 4。

Fig 3 SDS-PAGE electrophoresis

Fig 4 Two-dimensional electrophoresis

2.6質(zhì)譜鑒定結(jié)果對(duì)兩組中表達(dá)差異在2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)13個(gè)，通過(guò)質(zhì)譜鑒定出13個(gè)蛋白質(zhì)肽譜圖，利用Peptidem查詢軟件搜索Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)得到9個(gè)蛋白質(zhì)，有4個(gè)無(wú)法鑒定出結(jié)果。相對(duì)于無(wú)NGF干預(yù)的對(duì)照組，在NGF干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組中有4個(gè)表達(dá)上調(diào)(用“↑”表示)，有5個(gè)表達(dá)下調(diào)(用“↓”表示)，結(jié)果見(jiàn)Tab 2，這些蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)途徑。

3 討論

隨著對(duì)肝病研究的不斷深入與發(fā)展，肝纖維化被認(rèn)為是肝硬化、肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵而又必經(jīng)的過(guò)程。因此揭示肝纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及抑制其發(fā)展成為預(yù)防和控制肝癌發(fā)展的重要途徑。近來(lái)研究表明，逆轉(zhuǎn)肝纖維化關(guān)鍵在于減少活化的HSC數(shù)量，而HSC的數(shù)量是由HSC增殖和凋亡共同決定的，從理論上講，減少活化HSC數(shù)量有這些途徑:抑制HSC的增殖;誘導(dǎo)HSC發(fā)生凋亡，直接減少HSC數(shù)量;逆轉(zhuǎn)活化的HSC細(xì)胞，讓其變回靜止型等。但研究表明抑制其增殖和誘導(dǎo)凋亡是減少活化型HSC數(shù)量的主要途徑［6］。近年來(lái)，有研究顯示NGF能抑制HSC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡［7］。

本實(shí)驗(yàn)用眼鏡蛇毒NGF對(duì)大鼠肝纖維化細(xì)胞株HSC-T6進(jìn)行干預(yù)，MMT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGF能明顯抑制HSC-T6的增殖(P＜0.05);并且，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)NGF能夠誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞發(fā)生凋亡(P＜0.05)，說(shuō)明NGF具有抑制HSC-T6細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)其凋亡的作用。這可能是NGF作用HSCT6細(xì)胞后，通過(guò)某些途徑參與抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。有體外實(shí)驗(yàn)證明，NGF誘導(dǎo)HSCT6細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)與細(xì)胞表面低親和力受體p75結(jié)合介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)傳遞實(shí)現(xiàn)的，而促凋亡受體p75與抗凋亡因子TrkA在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著主要的作用［8］。

肝纖維化過(guò)程中基因并沒(méi)有發(fā)生改變，而是某些基因表達(dá)不足或者過(guò)度表達(dá)引起，對(duì)肝纖維化中那些激活并過(guò)度表達(dá)的膠原基因進(jìn)行抑制或封閉，對(duì)治療肝纖維化具有廣闊的前景［9］。目前認(rèn)為ECM是主要的膠原蛋白，其過(guò)度表達(dá)和異常沉積是肝纖維化發(fā)生的主要機(jī)制［10］。因此，研究肝纖維化過(guò)程中與其相關(guān)蛋白質(zhì)的變化對(duì)揭示肝纖維化的發(fā)生機(jī)制及抗肝纖維化藥物的研發(fā)具有主要的意義。雙向電泳(2-DE)作為研究蛋白質(zhì)組學(xué)一種傳統(tǒng)而又實(shí)用的技術(shù)，其操作簡(jiǎn)單，并能夠在一個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中同時(shí)研究多種蛋白質(zhì)的變化，把這種技術(shù)應(yīng)用于肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，有助于全面闡明肝纖維化發(fā)生過(guò)程中各種蛋白質(zhì)的變化情況［11］。由于2-DE對(duì)蛋白中鹽濃度以及一些雜質(zhì)比較敏感，容易受到影響，從而使所得的蛋白圖譜分辨率較低。因此，為了得到分辨率更高、重復(fù)性更好的細(xì)胞蛋白2-DE技術(shù)方案，根據(jù)多年來(lái)在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)積累［12～13］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品預(yù)處理方案和硝酸銀染色方法等進(jìn)行了優(yōu)化，得到更為理想的細(xì)胞2-DE圖譜。

Tab 2 Differentially expressed protein

同時(shí)本課題應(yīng)用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，分析眼鏡蛇毒NGF干預(yù)前后HSC-T6細(xì)胞蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在兩張圖譜上相對(duì)應(yīng)的位置并沒(méi)有蛋白質(zhì)點(diǎn)完全沉默，而是相對(duì)表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)。這也說(shuō)明在肝纖維化過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因的異常，而是某些基因過(guò)度表達(dá)或表達(dá)不足。質(zhì)譜鑒定出的差異的蛋白質(zhì)，通過(guò)功能分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)途徑。特別是表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1和金屬蛋白酶組織抑制物TIMP-2，這是與肝纖維化相關(guān)性很緊密的蛋白，主要參與調(diào)節(jié)ECM合成和降解的作用。多項(xiàng)研究表明，TGF-β1是強(qiáng)有力的致纖維化細(xì)胞因子，在肝纖維化中表達(dá)明顯增多，可促進(jìn)HSC的增殖和活化，使ECM合成增多，降解減少，并存在正反饋放大效應(yīng)，促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程［14］。而實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)TGF-β1是表達(dá)下調(diào)的，這可能是抑制肝纖維化的有利信號(hào)。還有些蛋白是酶類，主要參與細(xì)胞的代謝與氧化應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程。說(shuō)明改變細(xì)胞內(nèi)代謝及氧化應(yīng)激也可能是引起細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)重要因素。

總之，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多細(xì)胞參與、多途徑的復(fù)雜過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)用眼鏡蛇毒NGF干預(yù)HSC-T6細(xì)胞，在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)其能抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡以及使HSC-T6細(xì)胞中與肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變，這提示我們蛇毒NGF可能成為一種新型的抗肝纖維化藥物。蛇毒NGF可能是通過(guò)上調(diào)或者下調(diào)與肝纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗肝纖維化的目的。而這些差異蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和在整個(gè)抗肝纖維化網(wǎng)絡(luò)中的作用有待于進(jìn)一步的研究。

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