晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其抑制劑的研究進(jìn)展

呂 翠，劉洪娟，劉曉麗，張文生

(1.北京師范大學(xué)中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100875;2.教育部天然藥物工程研究中心，北京 100875;3.云南省三七生物技術(shù)與制藥工程研究中心，云南昆明 650000)

1992年，Neeper首次從牛肺組織中分離出可以識(shí)別并結(jié)合晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)的蛋白質(zhì)，將其命名為RAGE(receptor for advanced glycation end products)［1］。RAGE 由胞外區(qū)、單次跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。其中胞外區(qū)有3個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)，包括N端的一個(gè)可變區(qū)和兩個(gè)恒定區(qū)。在成年人體內(nèi)，RAGE主要分布在免疫細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和癌細(xì)胞中;當(dāng)細(xì)胞或組織局部出現(xiàn)RAGE—配體或炎癥因子聚集時(shí)，可促進(jìn)RAGE的表達(dá)。RAGE是一種多配體受體，可與 AGEs、高遷移率蛋白 B1(high mobility group B1，HMGB1/Amphoterin)、S100/鈣粒蛋白和 β 淀粉樣肽(β-amyloid protein，Aβ)等配體相互作用，促使細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和信號(hào)通路的激活，最終引起細(xì)胞或組織功能紊亂。RAGE—配體相互作用在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。目前，RAGE已成為疾病治療的新靶點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，利用sRAGE和RAGE抗體等阻斷RAGE的效應(yīng)，對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義，因此，本文就近年來(lái)關(guān)于RAGE及其抑制劑的研究進(jìn)展作一綜述。

1 RAGE的配體及其與疾病的相關(guān)性

RAGE是一個(gè)多功能的受體，可與多種配體如AGEs、HMGB1、S100蛋白和 Aβ等結(jié)合。通過(guò)X-射線晶體學(xué)和核磁共振方法分析表明這些配體表面富含負(fù)電荷，而RAGE的胞外區(qū)富含正電荷，兩者主要通過(guò)靜電作用結(jié)合［2］。這些配體具有共同點(diǎn)，如:(1)它們都趨向于形成寡聚體，如AGEs是以多聚體的形式存在，S100形成四聚體或八聚體，Aβ也以寡聚體或多聚體的形式存在;(2)絕大多數(shù)的配體與RAGE的V區(qū)結(jié)合，目前只發(fā)現(xiàn)S100A6和S100A12與其C區(qū)結(jié)合;(3)這些配體與RAGE的親和力類似，都在nmol·L-1(～50 nmol·L-1)級(jí)別范圍內(nèi)。這些配體都與一些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Fig 1 Relationship between RAGE-ligand and diseases

1.1AGEs與疾病AGEs是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱。在糖尿病患者體內(nèi)，AGEs的含量與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及其嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。AGEs可通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁產(chǎn)生直接作用，使血管壁增厚和血管通透性增加;也可通過(guò)與其受體RAGE結(jié)合，引起氧化應(yīng)激并激活多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［3］，誘發(fā)一系列促炎、促凝血反應(yīng)，從而引起血管內(nèi)皮損傷、血流動(dòng)力學(xué)和血液流變學(xué)異常等一系列病理變化，促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥如動(dòng)脈粥樣硬化、腎臟病變的發(fā)生與發(fā)展。在原發(fā)性高血壓中AGEs-RAGE同樣也起著一定的病理作用，促進(jìn)高血壓及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［4］。

1.2HMGBl與疾病HMGBl在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其與膿毒癥、腫瘤、風(fēng)濕免疫、動(dòng)脈粥樣硬化和缺血/再灌注損傷等多種疾病密切相關(guān)。HMGBl與RAGE有較高的親和力［5］，兩者結(jié)合后可促進(jìn)細(xì)胞因子活化，介導(dǎo)炎癥反應(yīng);也可激活基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP9)和MMP2，使細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移;上調(diào)促血管生成因子和細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向腫瘤缺血區(qū)域移動(dòng)和新生血管形成，加快腫瘤生長(zhǎng)。

1.3S100與疾病S100蛋白是一個(gè)低分子質(zhì)量的Ca2+結(jié)合蛋白家族，已經(jīng)確定的成員有20個(gè)，包括S100A1～16、S100B、S100P、S100Z和 CALB3(即鈣結(jié)合蛋白3)。其中S100A1特異性地高表達(dá)于心肌組織中，與心肌病相關(guān);S100B主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切;而 S100A2 ～ S100A6、S100A10、S100P、S100B 與腫瘤相關(guān)。目前研究表明，多種S100蛋白可作為細(xì)胞外信號(hào)因子與RAGE結(jié)合，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。如:高濃度的S100B與神經(jīng)細(xì)胞膜上的RAGE結(jié)合后產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用［6］，與主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上的RAGE結(jié)合可導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖，使血管腔變窄出現(xiàn)微循環(huán)障礙［7］;S100A12與RAGE的結(jié)合可產(chǎn)生促炎效應(yīng)［8］等。

1.4Aβ與阿爾采末病β-淀粉樣蛋白(Aβ)是一種呈β片層樣結(jié)構(gòu)的纖維樣蛋白，主要在阿爾采末病(Alzheimers disease，AD)患者大腦中積聚形成淀粉樣斑塊。寡聚化的Aβ被認(rèn)為是AD發(fā)病的核心因素，通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，引發(fā)記憶損傷和神經(jīng)元丟失。1996年Yan等［9］發(fā)現(xiàn)，在AD患者腦組織中RAGE呈高水平表達(dá)且與Aβ共定位于神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中。Aβ與神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，可促使小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及向淀粉樣斑塊的遷移并引起持久的炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元毒性。另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的RAGE與Aβ結(jié)合后，經(jīng)內(nèi)吞和跨膜作用介導(dǎo)Aβ穿過(guò)血腦屏障，促使血液中的Aβ進(jìn)入腦內(nèi)，加劇AD的發(fā)展［10］。

2 RAGE—配體的作用機(jī)制

RAGE分布在多種不同的細(xì)胞中，與不同配體結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)通路，因此，RAGE—配體激活的信號(hào)通路具有特異性和復(fù)雜性，如Fig 2中所示。

Fig 2 The signalling pathways activated by RAGE-ligand

在上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中，RAGE與配體結(jié)合后［11-14］(1)可激活分裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)家族的成員，如:p38 MAPK、MAPK/ERKl，2(external-signal regulated kinase，ERK1，2)，c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/應(yīng)激激活的蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPK)等;(2)也可激活NADPH氧化酶引起細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多。最終促使NF-κB入核，調(diào)節(jié)重要的目的基因的表達(dá)，如:腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)炎癥和腫瘤的發(fā)生。同時(shí)NF-κB也是RAGE基因的核轉(zhuǎn)錄因子，可上調(diào)RAGE基因的表達(dá)，因此，RAGE—配體結(jié)合后可通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)使信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基可直接損害細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等;也可誘發(fā)膜的超氧化，使維持離子穩(wěn)態(tài)的膜蛋白功能受損，引起鈣離子內(nèi)流。胞內(nèi)鈣離子濃度增高，導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能、代謝異常，甚至細(xì)胞死亡。

在腎小球系膜細(xì)胞中AGE-RAGE結(jié)合可激活ERK和磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)信號(hào)通路:AGE-RAGE產(chǎn)生的ROS與Src結(jié)合后激活PI-3K，PI-3K進(jìn)一步激活Ki-Ras-Raf-MEKERK1，2和PDKs-PKB-GSK3信號(hào)通路，促進(jìn)類胰島素生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和纖維連接蛋白等的產(chǎn)生［15］。而在大鼠腎臟成纖維細(xì)胞NRK-49F中［16］，AGE-RAGE結(jié)合可激活酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)信號(hào)通路，激活的JAK2可促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子STAT1/STAT3入核，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白，從而誘發(fā)細(xì)胞的增殖和糖尿病腎病的發(fā)生。

AGE-RAGE可引起細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子，使細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度增高，激活鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在SHSY5Y細(xì)胞中，Aβ-RAGE引起的鈣離子濃度增高可激活活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T-cells 1，NFAT1)入核，促進(jìn)β-分泌酶1(β-site APP-cleaving enzyme 1，BACE1)的表達(dá)，導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生增多，形成Aβ-RAGE-BACE1-Aβ反饋循環(huán)［17］。

RAGE—配體信號(hào)通路的復(fù)雜性提示RAGE胞內(nèi)區(qū)應(yīng)該有多個(gè)接頭蛋白，早期的研究發(fā)現(xiàn)，RAGE的胞內(nèi)區(qū)可與ERK蛋白結(jié)合激活下游的信號(hào)通路［18］，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)其它的RAGE胞內(nèi)區(qū)接頭蛋白。因此，對(duì)于RAGE—配體信號(hào)通路的研究尚未完全闡述清楚，需進(jìn)一步的研究。

3 RAGE抑制劑研究

以RAGE作為治療疾病的靶點(diǎn)，從阻斷RAGE的活化方面著手篩選相應(yīng)的抑制劑逐漸引起人們的重視。目前主要包括可溶性 RAGE(sRAGE)、抗 RAGE抗體和小分子的RAGE抑制劑。

3.1sRAGEsRAGE是 RAGE胞外區(qū)可溶部分，是由RAGE mRNA選擇性剪接產(chǎn)生，或由細(xì)胞膜上的RAGE經(jīng)膜表面的金屬蛋白酶作用裂解得到的一種異構(gòu)體。sRAGE經(jīng)腹腔注射后可與血液及組織中的配體結(jié)合，阻斷RAGE誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而達(dá)到治療目的。糖尿病小鼠給予sRAGE治療后，可阻止AGE與RAGE相互作用，減少蛋白尿，減輕腎小球硬化及動(dòng)脈粥樣硬化［19］。給予患有植入性腫瘤及自發(fā)性腫瘤的小鼠 sRAGE后，可阻止 HMGBl與RAGE的相互作用，抑制與腫瘤增殖、擴(kuò)散和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)相關(guān)的重要效應(yīng)分子的活化，從而阻止易感鼠植入和自發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［20］。由于sRAGE不能穿過(guò)血腦屏障，sRAGE與Aβ結(jié)合形成復(fù)合物可以將Aβ留在外周血中，當(dāng)血漿中Aβ濃度降低后，腦內(nèi)的Aβ就會(huì)向外周轉(zhuǎn)移，從而減少腦內(nèi)Aβ的沉積，減緩AD癥狀。實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)期給予sRAGE可以改善AD雙轉(zhuǎn)基因鼠(mAPP/mPS1)的突觸功能和空間學(xué)習(xí)記憶能力［21］。sRAGE還可減輕再灌注損傷，研究發(fā)現(xiàn)，給予sRAGE后小鼠肝細(xì)胞在缺血/再灌注時(shí)的壞死明顯減少［22］。

sRAGE可通過(guò)組織處理純化或體外原核表達(dá)得到，它的使用有以下優(yōu)點(diǎn):(1)易于生產(chǎn)純化;(2)血漿清除的半衰期是22 h，允許1 d內(nèi)的腹腔給藥;(3)在人、小鼠、大鼠、牛的血漿中均可以檢測(cè)到微量的sRAGE(ng·L-1)，所以注射sRAGE不會(huì)引起免疫反應(yīng)。目前，sRAGE是研究最多且效果較明顯的RAGE抑制劑。

3.2抗RAGE的抗體抗RAGE的抗體可與細(xì)胞膜上的RAGE胞外區(qū)結(jié)合，阻斷其與配體結(jié)合引起的生物學(xué)效應(yīng)。Flyvbjerg等［23］給予db/db小鼠腹腔注射抗RAGE抗體2個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠的腎臟重量、腎小球容積、肌酐清除率、基底膜厚度和尿白蛋白排泄率均較未給予RAGE抗體的db/db小鼠明顯降低，表明RAGE抗體對(duì)小鼠糖尿病腎病有防治作用。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［24］，RAGE抗體干預(yù)能明顯改善嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇大鼠的預(yù)后，并對(duì)重要器官功能具有明顯保護(hù)作用。應(yīng)用抗RAGE的抗體阻斷RAGE效應(yīng)的方法特異性強(qiáng)，親和力大，抑制效果明顯;在重組單克隆抗體技術(shù)迅速發(fā)展的情況下，此途徑有著較好的臨床應(yīng)用前景。

3.3RAGE的反義核酸和核酶技術(shù)利用RAGE的反義核酸和核酶技術(shù)在mRNA水平阻斷RAGE的表達(dá)，亦能抑制RAGE介導(dǎo)的信號(hào)通路。有研究者將shRNA［25］RAGE的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)生成的相應(yīng)siRNA干擾沉默RAGE基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)RNA干擾技術(shù)下調(diào)RAGE基因的表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，改變細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。目前，對(duì)RAGE反義核苷酸的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段，對(duì)反義核苷酸的毒性、體內(nèi)的穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

3.4小分子RAGE抑制劑

3.4.1LMWH 2006 年，Myint等［26］發(fā)現(xiàn)低分子量的肝素(low-molecular weight heparin，LMWH)可以與RAGE結(jié)合從而抑制RAGE的活化。SPR分析結(jié)果顯示LMWH與RAGE結(jié)合的親和力約為AGE-RAGE的6倍(Kd值:～17 nmol·L-1vs～100.17 nmol·L-1)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，LMWH可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞中由AGE引起的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管細(xì)胞黏附分子-1的 表達(dá)，并能抑制RAGE引起的NF-κB的激活。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在糖尿病小鼠及過(guò)表達(dá)RAGE的糖尿病小鼠中，LMWH均能劑量依賴地降低尿白蛋白/肌酐濃度比值，減少腎小球系膜擴(kuò)張和腎小球硬化現(xiàn)象;但對(duì)RAGE缺失的小鼠注射LMWH后沒有上述效果。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［27］，LMWH能阻止由RAGE引起的內(nèi)皮功能損傷，如抑制細(xì)胞間黏附因子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1、選擇素-E和NF-κB的產(chǎn)生。這些結(jié)果均表明LMWH可能是治療RAGE相關(guān)疾病的一個(gè)潛在藥物。

3.4.2PF-04494700 PF-04494700(或 TTP488)是生物合成的一種可口服的小分子RAGE抑制劑［28］。體外實(shí)驗(yàn)證明，PF-04494700可以抑制sRAGE與RAGE配體的結(jié)合，包括S100B，HMGB1和 Aβ1-42。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給予小鼠 PF-04494700后，可以減少其脾臟中Aβ1-42的聚集及白介素-6和巨噬細(xì)胞集落因子的表達(dá);過(guò)表達(dá)APP的轉(zhuǎn)基因模型小鼠口服PF-04494700 90 d后，可觀察到炎癥相關(guān)因子減少。臨床實(shí)驗(yàn)中，AD患者服用PF-04494700(10～60 mg·d-1)10周后沒有發(fā)現(xiàn)該藥物對(duì)患者體內(nèi)Aβ和炎癥因子的水平以及二次認(rèn)知能力有明顯的影響，但患者服用后沒有明顯的不適，且多種指標(biāo)檢測(cè)表明該藥物是安全的。雖然短時(shí)間服用PF-04494700對(duì)AD患者沒有明顯的治療效果，但對(duì)于長(zhǎng)期服用PF-04494700是否對(duì)AD患者有較好的療效還需要進(jìn)一步的研究。

3.4.3FPS-ZM1 FPS-ZM1是近期報(bào)道的RAGE小分子抑制劑(分子質(zhì)量為327)，它能夠特異地抑制Aβ與RAGE的相互作用。Deane等［29］通過(guò)大量的篩選和結(jié)構(gòu)優(yōu)化獲得一種新的小分子化合物 FPS-ZM1，該化合物能特異結(jié)合于RAGE的V區(qū)從而抑制Aβ與RAGE的結(jié)合。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)PS-ZM1可以降低細(xì)胞中由 Aβ-RAGE引起的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和Aβ的產(chǎn)生。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)PS-ZM1可以降低腦組織中Aβ水平，改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制由RAGE介導(dǎo)Aβ穿越血腦屏障入腦。FPS-ZM1還可抑制AD小鼠大腦皮層和海馬中BACE1、p65 NF-κB、炎癥因子及前炎因子水平的升高。對(duì)AD模型小鼠(APPsw/0小鼠 )注射高劑量的FPS-ZM1后小鼠各項(xiàng)生理指標(biāo)正常，表明該化合物對(duì)動(dòng)物機(jī)體是安全的。作為RAGE的抑制劑，F(xiàn)PS-ZM1是一種潛在的AD治療藥物。

4 總結(jié)與展望

由于RAGE在多種疾病中起著重要作用，已成為治療疾病的新靶點(diǎn)，大量研究證實(shí)利用RAGE抑制劑阻斷RAGE與配體的結(jié)合在預(yù)防和治療相關(guān)疾病中有重要的意義。除了sRAGE和抗RAGE的抗體，目前已經(jīng)研究得到了多種RAGE的小分子抑制劑。研究者多從RAGE與配體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)入手，借助研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的方法初步篩選RAGE的抑制劑，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些抑制劑的生物學(xué)效應(yīng)，這為開發(fā)RAGE抑制劑奠定了基礎(chǔ)。目前關(guān)于RAGE抑制劑的研究才剛剛起步，F(xiàn)PS-ZM1的發(fā)現(xiàn)表明發(fā)展低分子量和高特異性的RAGE抑制劑將是今后RAGE抑制劑研究的重點(diǎn)。

雖然RAGE抑制劑的研究為開發(fā)治療相關(guān)疾病的新藥提供了新的途徑，但對(duì)于RAGE是否是治療疾病的安全靶點(diǎn)還需進(jìn)一步研究，因?yàn)镽AGE在個(gè)體生長(zhǎng)階段對(duì)維持機(jī)體平衡也起著重要作用［30］，因此，對(duì)于RAGE的功能和致病機(jī)制仍需要深入研究。

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