中肋骨條藻和東海原甲藻的散射特性

沈玉璋，毛志華，陶邦一

（衛(wèi)星海洋環(huán)境動力學國家重點實驗室，國家海洋局 第二海洋研究所，浙江 杭州 310012）

0 引言

在自然海水中，浮游藻類生物與非色素顆粒物和黃色溶解有機物共同構(gòu)成了水體的光學三要素［1］。在開闊的大洋水體中，藻類及其附屬物質(zhì)是決定水體光學特性的主要成分［2］。另外，隨著海洋污染的不斷發(fā)生，關(guān)于赤潮的報道已越來越頻繁，因此對海洋中藻類光學特性的研究也是對水體光學及遙感的基本研究工作之一，可為衛(wèi)星遙感監(jiān)測海洋中生物量的分布、赤潮的預報等提供理論依據(jù)［3］。

吸收系數(shù)a（λ）、后向散射系數(shù)bb（λ）和衰減系數(shù)c（λ）是模擬水體離水輻亮度Lw（λ）過程中3個最基本的固有光學量，其中的a（λ）和bb（λ）分別決定了遙感反射比的譜形和幅值［4－5］。遙感反射比Rrs（λ）和固有光學量的關(guān)系可表述為［6－7］：

式中：t（w，a）是水氣透射系數(shù)；t（a，w）是氣水透射系數(shù)；nw為水的折射率實部；f（λ）是一個與波長、水體的單次散射反照比、體散射函數(shù)、太陽天頂角和氣溶膠光學厚度等有關(guān)的函數(shù)［8－10］；Q（λ）為水體上行輻照度與上行輻亮度的比值［10］。

在一類水體中，Rrs（λ）主要由（1）式中的固有光學量決定［11］。因此，以固有光學參數(shù)為基礎(chǔ)來探究水體光學傳輸機理是一種常用的研究方法。

在過去的幾十年間，研究人員對海洋浮游藻類吸收特性進行了相當多的測量與研究，得出了一些藻類的吸收共性和差異。BRICAUD et al［12］1983年就通過在分光光度計探頭前加上特殊裝置來測量藻類細胞的吸收和衰減系數(shù)，并計算得出散射系數(shù)。在之后的一段時間內(nèi)該方法得到了大部分人的認可和借鑒［13］。TASSAN et al［14］利用在兩塊石英玻璃片滴上待測樣品代替膜過濾法中的濾膜，提出可以同時測量吸收和后向散射系數(shù)的方法。國內(nèi)也有學者采用吸收衰減儀測量藻類水體的吸收和后向散射系數(shù)。

對不同藻種后向散射特性的了解仍然具有一定的局限性，主要原因是缺乏精確實驗測量后向散射的方法。隨著科技的進步，原本一直困擾研究者的后向散射測量方法也逐漸得到改善。目前，實驗室中對后向散射的測量主要采用HOBI Labs公司生產(chǎn)的Hydro－Scat 6等產(chǎn)品，或者采用WET Labs公司生產(chǎn)的ECO－BB3產(chǎn)品。上述產(chǎn)品只有幾個測量波長的通道，測量結(jié)果需要通過擬合才能得到所需波段范圍的后向散射值，其中校正參數(shù)的選取會因顆粒形狀的大小不同而異［15－16］。ROBERT et al［17］用 HS6測量了29種藻的后向散射曲線，發(fā)現(xiàn)大部分曲線呈指數(shù)衰減趨勢，且在510nm處的后向散射值與顆粒有機碳濃度有較好的相關(guān)性，而與葉綠素a濃度和細胞豐度的關(guān)系不明顯。MACCALLUM et al［18］設計了一套用于測量前向0.25～8°散射的實驗裝置，并對13種藻種進行前向散射的測量，獲得了很好的結(jié)果，但其局限性在于測量角度范圍太小。ZHOU et al［19］也在實驗室中利用BB9測量15種藻種的后向散射，并比較了它們在幾個波段上的后向效率，得出了可信的結(jié)論。

最早，研究人員主要利用計算機模擬方式來獲取藻類散射特性［13，20］，藻類的細胞形狀和折射指數(shù)的不確定是藻類散射系數(shù)誤差的主要來源。GAIGALAS et al［21］將待測樣品置于分光光度計中積分球前以及離積分球30cm距離的兩個位置上，分別測量其吸光度，最終分離出樣品的吸收和散射系數(shù)，其可靠性也得到理論計算值的驗證。BRICAUD et al［13］提出用分光光度計測量時，通過在儀器的光探測器前加上帶小孔的擋板可以有效減少前向散射進入探測器的量，以便較準確地得到藻類的衰減系數(shù)。WAYNE et al［22］利用激光粒度測沙儀LISST的原理，從理論上論證了此儀器用于測量顆粒0～15°前向散射的可行性，并用標準球形顆粒予以驗證，使該方法成為測量散射時可被借鑒的一種方式。如今，商業(yè)儀器中的吸收衰減儀已經(jīng)成為較常規(guī)的散射測量儀器。ZHOU et al［19］利用acs吸收衰減儀得到多種藻類的不同散射特性。

本文將從后向散射系數(shù)bb（λ）和散射系數(shù)b（λ）兩個固有光學量的測量入手，對東中國海經(jīng)常出現(xiàn)的赤潮藻種中肋骨條藻Skeletonemacostatum和東海原甲藻Prorocentrumdonghaiense的散射光學特性進行研究，探討這兩種藻種在光學特性上的異同及其原因，使人們對藻類的散射特性有一些基本的認識，為今后從遙感反射率的角度區(qū)別不同藻種提供理論依據(jù)，并提供一種比較可行的藻類細胞散射特性測量方法。

1 材料與方法

1.1 理論背景

藻類的散射特性主要是由其折射指數(shù)實部決定的，而折射指數(shù)的虛部決定其吸收的特性。對于各向同性的均勻介質(zhì)，由洛倫茲振蕩模型的理論可知［23］：

式中：ε（ω）為物質(zhì)的介電常數(shù)，n（ω）為折射指數(shù)，兩者都是外界電場振蕩頻率ω的函數(shù)；ωp定義為為介質(zhì)中分子總數(shù)，e是電子數(shù)，m是單個單子的質(zhì)量，ε0是真空中的介電常數(shù)；εr（ω）、εi（ω）對應于介電常數(shù)的實部和虛部；ωi則是介質(zhì)中原子i中電子的共振頻率，γi是相應的電子阻尼系數(shù)，ωi、γi是由物質(zhì)本身的性質(zhì)決定的；βi為原子i在分子中的數(shù)量。

從（2）～（4）式可以看出，當ωi遠大于ω時，（4）式隨ω的增大而增大，（5）式中εi（ω）的值很小，相對于εr（ω）可以忽略；而在ω≈ωi處，εr（ω）會出現(xiàn)與其它頻率處相反的變化趨勢，另外εi（ω）在此處也會出現(xiàn)一個峰值，稱為共振吸收區(qū)；當ωi遠小于ω時，εr（ω）隨頻率的增大而減小，εr（ω）也變得非常?。ㄚ呌诹阒担?。在自然環(huán)境下，大部分電介質(zhì)的共振頻率都處于紫外波段處，因此，在可見光波段內(nèi)εr（ω）隨外界電場頻率的增加而增大，被稱之為正常色散，相反即被稱為異常色散。

1.2 樣品準備

本文選擇中肋骨條藻和東海原甲藻作為研究對象，它們分別屬于硅藻門和甲藻門，是我國東海赤潮海域中常見的優(yōu)勢藻種。中肋骨條藻的細胞為透鏡形或圓柱形，直徑為6～22μm，多個細胞常常形成鏈狀；而東海原甲藻的細胞呈不對稱梨形，長15～22μm，寬9～14μm，營單細胞生活。實驗測量的藻種是從東中國海采集并提純的，在光照培養(yǎng)箱中加入f2培養(yǎng)基長期培養(yǎng)。選取培養(yǎng)液上層的處于指數(shù)生長期階段活性較好的藻類細胞進行光學參數(shù)測量，以減少非色素碎屑對測量結(jié)果的影響。藻類細胞葉綠素a濃度采用Turner公司生產(chǎn)的熒光儀測量，具體的操作步驟參考文獻［24—25］的方法。

1.3 吸收系數(shù)的測量

吸收系數(shù)測量的常用方法是將藻類細胞過濾到玻璃纖維膜后在分光光度計上用反射法測量得到［14，26－28］，但此方法需要考慮膜本身的光程放大作用對測量結(jié)果的影響。

筆者對樣品吸收系數(shù)的測量是在配有150mm積分球的雙波束分光光度計（Perkin Elmer Lambda 950）上進行的。將藻類培養(yǎng)液盛于四面拋光、光程為1cm的比色皿上，通過固定支架（center mount cuvette holder）置于積分球中測量，由于經(jīng)過樣品的透射光和被樣品散射的光都將被積分球測得，這樣就可以得到樣品的吸光度ODs值。為了排除藻類培養(yǎng)基對測量結(jié)果的影響，在實際操作中，需要對一部分藻類樣品用直徑為25mm的GF／F玻璃纖維膜進行過濾，取濾液作為參比，測量得到其吸光度ODf，則藻類細胞的吸收系數(shù)a表述為：

式中：l是比色皿的光程，為0.01。

1.4 散射系數(shù)的測量

在測量散射系數(shù)時，借鑒了文獻［13］的方法，利用分光光度計（Perkin Elmer Lambda 35）先測得樣品的衰減系數(shù)，再減去吸收系數(shù)得到。由于藻類細胞的前向散射占總散射的比率很大，在測量時應盡量減小探測器對前向散射的接收量。如圖1所示，通過增加比色皿與探頭間的距離D，減小探頭前狹縫的孔徑a，最終只有前向半角0.3°內(nèi)的散射被接收。同時，為排除濾液吸收對測量結(jié)果的影響，采用與吸收系數(shù)測量時相同的方法將濾液作為參比值扣除。

為了驗證該方法的可靠性，選擇粒徑分布和折射率已知，中心粒徑直徑為1.999μm的球形標準顆粒（Thermo Scientific Duke Standards Microsphere Size Standards），對利用上述方法測量的散射系數(shù)與米氏散射理論計算的結(jié)果進行對比（其中米氏散射的計算代碼采用了Christian M?tzler公開的代碼），結(jié)果見圖2。

圖1 散射測量示意圖Fig.1 Laboratory setup for scattering measurement

圖2的標準顆粒散射測量值與理論計算值是通過對顆粒質(zhì)量濃度進行歸一化后得到的，可以看出，散射系數(shù)測量值在400～700nm波段間與理論計算結(jié)果吻合得較好，但在藍紫光和紅光波段的偏差還是較大的，誤差為2%～3%，由于球形標準顆粒的粒徑分布和折射指數(shù)參數(shù)存在1.1%的變動，由計算可知，其對結(jié)果的影響平均為0.2%。而衰減系數(shù)測量過程中儀器和人員引入的系統(tǒng)誤差對結(jié)果的影響為1.2%，如圖7的分析，這種實驗方法本身的誤差為1.3%（在550nm處）。另外，當樣品的光學厚度較低時測量誤差會更小?？傮w上，應用該方法測量的誤差較小，因此運用此測量方法對藻類細胞散射系數(shù)的測量是可行的。

1.5 后向散射系數(shù)的測量

對水體后向散射特性的測量，目前主要是使用商業(yè)儀器測量某一特定角度的體散射函數(shù)，最終估算出90～180°范圍內(nèi)的后向散射系數(shù)［15－16，29］，這些儀器主要用于海上現(xiàn)場測量，并不實用于實驗室中測量各個波長的散射值。TASSAN et al［14］提出利用改進后的分光光度計透射反射法可以同時測量水體顆粒的吸收和后向散射，但此法在測量時并沒有排除光在玻璃片上的全反射，致使樣品前向散射的部分光線未能進入積分球而使測量的后向散射值偏大。

圖2 標準顆粒散射測量值與理論計算值的比較（以標準顆粒質(zhì)量濃度歸一化）Fig.2 Comparison of measured scattering value of standard microsphere particle with Mie calculated value（normalized by particle concentration with unit g／m3）

筆者將樣品置于5cm的比色皿中，放于分光光度計（Perkin Elmer Lambda 950）的積分球后端，采用反射法測量（圖3）。

圖3 后向散射測量示意圖Fig.3 Laboratory setup for backscattering measurement

實際測量時，將藻類樣品用直徑為25mm的GF／F濾膜進行過濾，將得到的濾液作為參比之用，為了消除石英比色皿前端對光反射的影響，實測的樣品反射值需減去參比的反射值?？紤]到部分光線受比色皿尾端反射的影響，改用5cm的比色皿后，測量的藻類細胞濃度也相應提高。

與散射的測量方法相同，將通過測量得到的球形標準顆粒的后向散射與通過米氏散射計算得到的理論結(jié)果進行比較（圖4）。

圖4 標準顆粒后向散射測量值與理論計算值的比較（以標準顆粒質(zhì)量濃度歸一化）Fig.4 Comparison of measured backscattering value of standard microsphere particle with Mie calculated value（normalized by particle concentration with unit g／m3）

圖4中的數(shù)據(jù)是經(jīng)過質(zhì)量濃度歸一化處理后得到的結(jié)果，可以看出，在400～700nm波段，后向散射測量結(jié)果與米氏散射計算得到的理論值在譜形上比較一致，但幅值總體上后向散射測量值偏高，特別是在600nm后的后向散射測量值隨波長增大與米氏散射計算得到的理論值偏高程度更明顯，平均約20%的偏差。由之前所說，由標準顆粒本身參數(shù)的偏差以及可能的系統(tǒng)測量偏差產(chǎn)生的誤差在2%以內(nèi)，不是主要的誤差來源。最主要的誤差來源是由于比色皿5cm的光程偏短，部分透射光在比色皿末端玻璃面上反射回積分球造成的，而標準顆粒在短波處反射回來的散射較小，所以對結(jié)果影響很小。因此，采用此方法測量散射特性比標準顆粒更弱且具有吸收特性的藻類細胞，其誤差會更小。

在測量吸收、散射和后向散射時，為了排除高濃度帶來的多次散射影響，每次對同一種藻類細胞都先稀釋為原始濃度的1／2，1／4，1／8，1／16，再測量這幾個濃度梯度的吸光值，最終按原濃度的1／16歸一化后（受多次散射影響較?。┑臏y量值低于其它測量值，一般情況下，原濃度的1／8之后的濃度歸一化結(jié)果都趨于一致，取其中一條光譜曲線作為最終結(jié)果即可。如圖5和圖6所示，以中肋骨條藻為例，由于受到多次散射的影響，原質(zhì)量濃度（701.8ug／L）的樣品其吸收和衰減吸光度的結(jié)果偏高，對其稀釋1／4和1／8后吸收和衰減吸光度測量值降低，再繼續(xù)稀釋下去，其結(jié)果由于信噪比較低且與1／8稀釋液的結(jié)果幾乎一致，故選取原濃度稀釋1／8后的吸收和衰減吸光度測量結(jié)果作為最終的測量數(shù)據(jù)。

圖5 不同葉綠素a濃度中肋骨條藻樣品以原濃度的1／16為基準值的歸一化吸光度Fig.5 Optical density normalized on 1／16the original concentration for different chlorophyll aconcentration of Skeletonema costatumalga

圖6 不同葉綠素a濃度中肋骨條藻樣品以原濃度的1／16為基準值的歸一化散射吸光度Fig.6 Scattering optical density normalized on 1／16the original concentration for different chlorophyll a concentration of Skeletonema costatumalga

由于實驗結(jié)果的誤差主要來源于儀器的系統(tǒng)誤差、人員操作誤差和實驗方法本身的誤差，筆者在實驗室中選擇了亞歷山大藻作為測量對象，對系統(tǒng)和人員操作誤差進行評測，如圖7所示，在每次測量時，人為地對樣品進行取放，每次測量的時間間隔為3min。在550nm處8次衰減系數(shù)測量的誤差為1.2%，在550nm處吸收系數(shù)誤差為0.8%。因此可見，用于測量的兩臺分光光度計的儀器誤差以及人員操作的誤差相對較小，均在允許范圍內(nèi)。

圖7 亞歷山大藻衰減和吸收曲線的多次測量結(jié)果（圖中上半部分的曲線為Lambda 35的8次衰減值測量結(jié)果，下半部分的曲線為Lambda 950的8次吸收值測量結(jié)果，圖中的吸收值是原測量值的10倍）Fig.7 Results of eight repeating measurements for both attenuation（the upper eight curves measured on Lambda 35）and absorption（the lower eight curves，multiplied by 10，measured on Lambda 950）of Alexandrium affine alga

2 結(jié)果與討論

中肋骨條藻和東海原甲藻長期以來一直是東中國海區(qū)的主要藻種，在夏季和秋季的赤潮中常常是優(yōu)勢種，因此從遙感平臺區(qū)分這兩種藻成為人們關(guān)注的問題。影響藻類細胞散射特性的因素很多，包括粒徑大小、細胞形狀、細胞內(nèi)物質(zhì)構(gòu)成等，雖然這兩種藻類細胞大小相近，但從圖8中可以看出，中肋骨條藻和東海原甲藻的散射特征有明顯的區(qū)別，中肋骨條藻的散射隨波長的增加而遞減，而東海原甲藻的變化趨勢卻相反。明顯地，在藍紫光波段散射強度隨波長的變化率并不一致，很大原因是受藻類細胞色素在此處的強吸收影響。在紅光波段也出現(xiàn)了一個散射的谷值，但是兩條曲線在此處的散射谷位置并不相同，中肋骨條藻為660nm處，東海原甲藻為667nm處，也不與其相應的吸收峰位置（675nm處）重疊。這點可以從電磁學的角度得到解釋。由之前的理論可知，在可見光范圍內(nèi)，中肋骨條藻大致服從正常色散，而東海原甲藻由于細胞內(nèi)主要物質(zhì)分子的共振頻率小于可見光頻率，使整體出現(xiàn)異常色散現(xiàn)象；在400～500nm范圍內(nèi)受多種色素的影響，兩種藻都出現(xiàn)了與其它波長處相反的色散趨勢，但因為各種色素的綜合作用使其效果不明顯；在675nm處附近，由于葉綠素a的作用突出，產(chǎn)生了明顯的異常色散，且兩種藻類細胞內(nèi)主要物質(zhì)的物理特性不同（主要是物質(zhì)的電子振蕩阻尼系數(shù)γ的差異），使異常色散的范圍也不一致，中肋骨條藻為668～696nm，而東海原甲藻為652～675nm。

圖8 中肋骨條藻和東海原甲藻的散射和吸收曲線（實線為散射值，虛線為吸收值，以藻類葉綠素a濃度歸一化）Fig.8 Measured total scattering and absorption spectrum of Skeletonema costatumand Prorocentrum donghaiense（solid line for scattering，dot line for absorption，both are normalized by chlorophyll aconcentration）

圖9 中肋骨條藻和東海原甲藻的后向散射曲線（以藻類葉綠素a濃度歸一化）Fig.9 Measured backscattering spectrum of Skeletonema costatumand Prorocentrum donghaiense（normalized by chlorophyll aconcentration）

在譜形上中肋骨條藻和東海原甲藻的后向散射特性區(qū)別并沒有總散射曲線那么明顯（圖9），在整個可見光范圍內(nèi)受吸收特性的影響較大，在藍光波段和紅光波段對應出現(xiàn)了色素吸收峰，中肋骨條藻中類胡蘿卜素在藍光內(nèi)和500nm處的吸收使后向散射出現(xiàn)一個峰值。兩種藻類在665nm附近的谷值比較一致。在幅值上，兩種藻類的濃度歸一化的后向散射系數(shù)相差不大，東海原甲藻整體比中肋骨條藻略大，對應550nm處的值分別為0.001 74和0.001 43m2／mg（以藻類葉綠素a濃度歸一化），而后向散射概率分別為1.104%和0.723%。與文獻［26］，［30—31］等研究者對海洋藻類的測量結(jié)果相近。由（1）式可以看出，這兩種藻類的反射中，后向散射產(chǎn)生的差異主要體現(xiàn)在幅值上，譜形上的區(qū)別主要還是由吸收的差異決定。

3 小結(jié)

本文主要利用分光光度計設計了在實驗室中測量海洋微型浮游藻類的散射和后向散射特性的方法，并用該方法測量已知折射指數(shù)的標準球形顆粒的散射和后向散射系數(shù)，測量得到的散射系數(shù)與通過米氏理論計算出的結(jié)果一致性較好，在近紅外波段處由于顆粒在0～0.3°的前向散射較強，使測量結(jié)果略小于理論值；后向散射的測量結(jié)果在400～600nm波段內(nèi)與理論值很吻合，而在600nm后由于比色皿光程偏短，使部分來自比色皿的反射光被當做后向散射，使測量值偏高，在700nm處的誤差約為20%。

利用設計的散射和后向散射的測量方法對東中國海兩種常見的赤潮藻種中肋骨條藻和東海原甲藻進行測量，結(jié)果顯示，兩種藻類的散射曲線幅值相近，但譜形差異明顯，中肋骨條藻的散射系數(shù)整體隨波長增加而遞減，東海原甲藻則與此相反。此外，在強色素吸收區(qū)，這兩種藻均出現(xiàn)相對于其它波長異常的散射趨勢，特別是在675nm處葉綠素a的吸收峰附近，且異常的范圍寬度和位置稍有不同，中肋骨條藻為668～696nm，東海原甲藻為652～675nm。此結(jié)果表明，中肋骨條藻細胞的物質(zhì)組成與大多數(shù)電介質(zhì)一樣，滿足正常色散關(guān)系，僅在色素的共振吸收區(qū)出現(xiàn)異常色散現(xiàn)象；而東海原甲藻相對特殊（與測量過的其它藻類相比），細胞內(nèi)物質(zhì)較低的共振頻率決定了其散射上出現(xiàn)異常色散關(guān)系。

兩種藻類的后向散射特性區(qū)別并不大，整體上受吸收的影響比較明顯，在400～500nm區(qū)間和673nm處均出現(xiàn)明顯的低值。在幅值上，東海原甲藻略高于中肋骨條藻，在550nm處分別為0.001 74和0.001 43m2／mg（以藻類葉綠素a濃度歸一化），后向散射概率分別為1.104%和0.723%。

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