黃花草木樨種子蛋白質(zhì)含量測(cè)定及其提取工藝研究

趙海陽(yáng),林年豐,包海鷹*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130118;2.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130026)

黃花草木樨(Melilotus officinalis)又名墨里老篤,金花草,黃甜車(chē)軸草,草木樨等,屬于豆科草木樨屬。1年生或2年生草本植物[1],具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、耐旱、耐寒、耐脊和耐鹽堿等特性[2]。我國(guó)四川及長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)有野生,東北、華北、西北及西藏各省區(qū)都有栽培,歐洲各國(guó)也有栽培。宜種于半干燥、溫濕地區(qū)。為水土保持優(yōu)良草種,并為綠肥且花為一種良好的蜜源[3];花干燥后,可直接拌入煙草內(nèi)作芳香劑。適合在干旱環(huán)境中的沙質(zhì)土壤、沙土和中堿性土壤(pH≤9)中種植,具有從空氣中吸收氮的能力,除滿足自身氮需求外,大部分氮聚集于土壤中。黃花草木樨富含蛋白質(zhì),種植它可以獲得高質(zhì)量的青貯飼料和干草飼料,干燥后加工草粉,可作為精飼料。黃花草木樨中含有豐富的生物活性成分,如含有香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、甾體類(lèi)、三萜類(lèi)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)等化學(xué)成分[4-5]。黃花草木樨具有止咳平喘,抗炎抗菌,散結(jié)止痛、改變血管通透性、促進(jìn)血液循環(huán)、芳香化濁、調(diào)節(jié)免疫、截瘧等功效[6-7]。目前,對(duì)黃花草木樨利用較多的是從中提取精油、香樹(shù)脂、凈油和浸膏等,對(duì)于黃花草木樨蛋白質(zhì)的研究還沒(méi)有先例,本文利用堿提酸沉法研究黃花草木樨種子蛋白質(zhì)的提取工藝,確定了最佳提取條件,為黃花草木樨的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 主要材料:1999年從俄羅斯西伯利亞地區(qū)引進(jìn)的俄羅斯原種種植的黃花草木樨。主要試劑:氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、甲基紅、溴甲基酚綠、乙醇、鹽酸。主要儀器:恒溫水浴鍋:HHS4數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠;精密pH計(jì):PHS23C型,上海金鵬分析儀器有限公司;低速臺(tái)式冷凍離心機(jī):T.D.L-5000-CR,上海安亭科學(xué)儀器廠;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī):T.G.L-20000-CR;電熱鼓風(fēng)干燥箱:101A23ET,上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;分析天平:AL204,METTL ER TOL EDO;凱氏定氮儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 利用凱氏定氮法GB/T14489.2-2008,多次測(cè)定脫脂后的黃花草木樨種子的蛋白質(zhì)含量,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,并求出平均值,方為黃花草木樨種子的蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取工藝 具體操作步驟:脫脂后的黃花草木樨種子,在一定的溫度下,加入一定體積,一定pH值的氫氧化鈉溶液,攪拌提取1 h,用離心機(jī)以3 500 r/min離心20 min,去沉淀,取上清液用0.05 mol/L的HCI調(diào)節(jié)pH值至一定值,4 000 r/min離心20 min分離除去上清液,將得到的蛋白質(zhì)沉淀加入4倍的蒸餾水,4 000 r/min離心20 min除去廢水,40℃干燥48 h后得粗蛋白備用[8]。

1.2.3 黃花草木樨種子的預(yù)處理 將黃花草木樨種子過(guò)篩,粉碎,后再過(guò)篩,然后用石油醚回流脫脂。脫脂干燥后貯存于棕色試劑瓶中備用[9]。

1.2.4 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化 1)堿溶pH值的確定試驗(yàn):在堿溶溫度35℃,料液比1∶10(W∶V),攪拌提取l h,酸析pH值為4的條件下,分別取堿溶pH值6.0、8.0、10.0、12.0、14.0,以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察堿溶pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取效果的影響。2)酸析pH值的確定試驗(yàn):在堿溶溫度為35℃,堿溶pH值為10.0,料液比1∶10(W∶V)的條件下,分別取酸析pH值3.8、4.0、4.2、4.4、4.6,以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察酸析pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取效果的影響。3)料液比的確定試驗(yàn):在堿溶溫度為35℃,pH值為10.0的堿液中,攪拌提取l h,酸析pH值為4.0的條件下,分別取料液比l∶5、l∶10、1∶15、l∶20、l∶25(W∶V),以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取效果的影響。4)提取溫度的確定試驗(yàn):在pH值為10.0的堿液中,料液比1∶10(W∶V),提取1 h,酸析pH值為4.0的條件下,分別取提取溫度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取效果的影響。5)提取工藝的優(yōu)化試驗(yàn):在單因素的基礎(chǔ)之上,確定堿溶pH值、酸析pH值、料液比、提取溫度4因素的因素水平,以蛋白質(zhì)的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),優(yōu)化黃花草木樨種子蛋白質(zhì)的提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定[10]按以下公式計(jì)算:蛋白質(zhì)提取率=干燥后得到的蛋白質(zhì)(g)/脫脂草木樨種子粉中總的蛋白質(zhì)(g)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)含量,見(jiàn)表2。

表2 黃花草木樨種子蛋白質(zhì)的含量%

由表2經(jīng)計(jì)算可知,黃花草木樨種子蛋白質(zhì)含量的平均值為51.14%,標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.107 788,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.2%。重復(fù)性試驗(yàn),按擬訂的含量測(cè)定方法對(duì)同一批樣品進(jìn)行多次測(cè)定計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,數(shù)值越小所測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確,由此可知,本試驗(yàn)結(jié)果符合要求,所測(cè)結(jié)果可靠。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)及其分析

2.2.1 堿溶pH值的確定 堿溶pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響,見(jiàn)圖1。

圖1 堿溶pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可知,蛋白質(zhì)的提取率是隨著pH值的升高而升高,但pH值達(dá)到12時(shí)提取率開(kāi)始有所下降。因此,選擇堿溶pH值12.0較為合適。

2.2.2 酸析pH值的確定 酸析pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響,見(jiàn)圖2。

由圖2可知,酸析pH值為4.4時(shí),蛋白質(zhì)的提取率最高,高于或者低于4.4,蛋白質(zhì)的提取率都有所下降,可能的原因是黃花草木樨種子蛋白的等電點(diǎn)接近4.4,在酸析PH值為4.4時(shí),得到的蛋白質(zhì)沉淀較多,提取率最高。所以,選擇酸析pH值為4.4。

2.2.3 料液比的確定 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響,見(jiàn)圖3。

圖2 酸析pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知,當(dāng)料液比為1∶15時(shí),蛋白質(zhì)的提取率最高。在料液比由1∶5上升到1∶15時(shí),隨著料液比的增加,蛋白質(zhì)的溶解增加,蛋白質(zhì)的提取率升高。料液比達(dá)到1∶15后繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)的提取率降低,可能的原因是料液比過(guò)高,導(dǎo)致酸析有困難。選擇料液比為1∶15(m∶v)。

2.2.4 提取溫度的確定 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響,見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知,溫度的高低對(duì)蛋白質(zhì)的提取率有較大的影響。隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)提取率增大,但溫度過(guò)高會(huì)引起蛋白質(zhì)變性[11],提取溫度從35～50℃提取率升高趨于平緩,考慮節(jié)約能源和保持蛋白質(zhì)功能特性,選擇提取溫度為35℃。

2.3 正交試驗(yàn)及分析 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。由表3極差R分析可知影響蛋白質(zhì)提取的各個(gè)因素主次關(guān)系為:A(堿溶pH值)＞D(料液比)＞B(酸析pH值)＞C(提取溫度)。由K值大小可知,本試驗(yàn)確定的最優(yōu)工藝條件為A3D2B3C1,即為堿溶pH值12,酸析pH值4.6,提取溫度30℃,料液比1∶15(m∶v)。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 最優(yōu)工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照最優(yōu)工藝條件為堿溶pH值12,酸析pH值4.6,提取溫度30℃,料液比1∶15(M∶V)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)測(cè)蛋白質(zhì)的提取率為56.94%,大于正交試驗(yàn)中55.93%最好水平,說(shuō)明最佳提取方式組合是合理有效的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用凱氏定氮法,多次測(cè)定黃花草木樨種籽的蛋白質(zhì)含量,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,計(jì)算平均值得出黃花草木樨種籽蛋白質(zhì)含量為51.14%,可知黃花草木樨種子中蛋白質(zhì)含量較高,具有很大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)還利用堿提酸沉法從脫脂的黃花草木樨種子中提取蛋白質(zhì),通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)工藝為堿溶pH值12,酸析pH值4.6,提取溫度30℃,料液比1∶15(M∶V),在該條件下蛋白質(zhì)的提取率最高,為56.94%。

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