抑制煙草花葉病毒活性植物的篩選

林中正，謝嬌枚，李基光，周 鵬，魏潤潔，肖啟明*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)委員會，江蘇 淮安 223001；3.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，長沙 410128；4.湖南省西瓜甜瓜研究所，長沙 410125）

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的單鏈 RNA（ssRNA）病毒，侵染煙草后，會引起普通煙草花葉病，對煙草產(chǎn)區(qū)造成嚴(yán)重影響[1]。就目前而言，尚無理想藥劑能有效預(yù)防普通煙草花葉病[2]。植物提取物抗病毒物質(zhì)具有安全、有效、毒害作用低等特點(diǎn)，適于開發(fā)抗病毒藥劑。本試驗(yàn)選取 24種植物材料，制備粗提物，系統(tǒng)測定其對TMV的抑制效果[3-4]，主要包括體外鈍化 TMV作用、TMV初侵染抑制和對煙草花葉病的保護(hù)和治療作用，為進(jìn)一步開發(fā)植物源農(nóng)藥提供依據(jù)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草品種 病毒枯斑寄主為心葉煙（Nicotiana glutinosa L.），病毒系統(tǒng)侵染寄主為普通煙（Nicotiana tabacum L.），品種為K326，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草基地提供。

1.1.2 供試毒源 室內(nèi)供試毒源為 TMV，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供，保存于普通煙的煙葉上。

1.1.3 供試植物材料 供試植物材料購自湖南省人民醫(yī)院藥房等藥店，部分植物材料采自湖南湘西地區(qū)，一共有 24種植物材料。據(jù)《本草綱目》及標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)顯示，這些植物對人或動物具有一定的抗病毒效果。

1.2 方法

1.2.1 植物粗提物的制備 新鮮的植物根、莖、葉或果實(shí)樣品用烘箱 40 ℃烘干后，用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，已經(jīng)曬干的中藥材則直接用中藥粉碎機(jī)粉碎[6]。粉碎成粉末后，用溶劑浸漬法提取植物有效成分，在室溫下加入樣品量的 6倍的分析甲醇（V/M），浸泡72 h，期間不斷攪拌，使其充分溶解。然后用布氏漏斗過濾，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴濃縮獲得提取物，提取物為膏狀物，置于4 ℃冰箱保存[7]。天然植物提取物供試藥劑均由提取的膏狀物樣品配置。

1.2.2 接種液的制備 剪取新鮮的帶TMV病毒的煙葉，按一定比例加入PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.2）加入500目的石英砂少許，研磨得勻漿，用4層紗布過濾掉殘?jiān)貌《驹簜溆肹8]。其濃度采用剪取新鮮的質(zhì)量（mg）與 PBS緩沖液的體積（L）比來定義，心葉煙接種濃度為20 mg/L，普通煙接種濃度為50 mg/L。

1.2.3 植物粗提物室內(nèi)生物活性測定 體外鈍化作用，選取生長旺盛、健康的5～6葉期心葉煙，左半葉接種供試植物提取物與病毒液等體積混合液，右半葉接種病毒液與PBS緩沖液等體積混合液（對照），24種植物提取物的質(zhì)量濃度均為1 mg/L，接種病毒濃度為20 mg/L，鈍化時間分別為1 h和2 h，共48個處理，3片葉子，重復(fù)3次。采用半葉枯斑法測定，5 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)，計(jì)算抑制率[9-10]。

抑制TMV初侵染試驗(yàn)，選取生長旺盛、健康的5～6葉期心葉煙，左半葉涂抹供試植物提取物，右半葉涂抹等體積的PBS緩沖液（對照），分兩組，一組24 h后，另一組48 h后，全葉接種病毒液，24種植物提取物的質(zhì)量濃度均為1 mg/L，接種病毒濃度為20 mg/L，兩組，共48個處理，3片葉子，重復(fù)3次，采用半葉枯斑法測定，分別在接種病毒5 d后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)，計(jì)算抑制率[11]。

抑制率（%）=[(對照枯斑數(shù)－處理枯斑數(shù))/對照枯斑數(shù)]×100%

1.2.4 室內(nèi)防治煙草花葉病試驗(yàn) 選取生長旺盛、健康的 5～6葉期普通煙 K326，采用盆栽試驗(yàn)，測定植物提取物對煙草花葉病的藥效，試驗(yàn)分兩種方式，即保護(hù)組（噴灑植物提取物3次后，接種病毒液）和治療組（接種病毒液后，植物提取物3次），此外還設(shè)空白（CK）對照組（只接種病毒液，不噴灑植物提取物）。采用噴霧法，每5 d噴灑植物提取物一次，共3次，保護(hù)組最后1次噴灑植物提取物后接種 TMV；治療組在第 1次噴灑植物提取物前接種TMV。均在接種病毒液后的14 d和21 d調(diào)查發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。每個樣20株苗，重復(fù)3次，病害分級標(biāo)準(zhǔn)參照煙草花葉病分級標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。病情指數(shù)=∑（病級數(shù)×病株數(shù)）/（最高病級×各處理總株數(shù)）×100；防治效果（%）=（對照病指－處理病指）/對照病指×100%。

以上試驗(yàn)于2011年7月1日至9月5日在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治實(shí)驗(yàn)室完成。

2 結(jié) 果

2.1 植物提取物對TMV的體外鈍化作用

采用半葉枯斑法測定，植物提取物對TMV的體外鈍化作用，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，24種植物的提取物對TMV均表現(xiàn)一定的鈍化作用，但鈍化效果有明顯的差別，其中銀杏、梔子、商陸、赤芍表現(xiàn)的鈍化作用較強(qiáng)，在體外鈍化2 h的抑制率均在80%以上。提取物對TMV的鈍化效果表現(xiàn)為時間效應(yīng)，隨著鈍化作用時間的延長，對TMV的抑制效果也逐漸增強(qiáng)，如效果比較好的銀杏，在鈍化1、2 h后，抑制率分別為89.65%、90.31%。

2.2 植物提取物對TMV的初侵染抑制作用

采用半葉枯斑法測定，植物提取物對TMV的初侵染抑制作用，詳見表2。

表1 植物提取物對TMV的體外鈍化作用Table1 Inactivation of plant extracts to TMV

表2 植物提取物對TMV初侵染抑制作用Table2 Inhibiting infectivity of plant extracts to TMV

從表2可以看出，24種植物的提取物均表現(xiàn)出了對TMV的初侵染抑制作用，但抑制效果有明顯差別，且同一植物提取物涂抹后24 h和48 h接種病毒的抑制作用較為接近，時間效應(yīng)不明顯。與體外鈍化效果相比，同一植物提取物對TMV的初侵染抑制作用較體外鈍化的抑制效果總體上來說會略微弱一點(diǎn)，比如銀杏提取物對TMV的初侵染抑制作用，24 h和48 h后接種病毒液，抑制率分別為80.21%、82.33%，比體外鈍化2 h的抑制率（90.31%）微低。

2.3 室內(nèi)防治煙草花葉病試驗(yàn)

植物提取物對煙草花葉病的保護(hù)作用，結(jié)果見表3。

表3 植物提取物對煙草花葉病的保護(hù)作用Table3 Protection effect of plant extracts on TMV

從表3可以看出，植物提取物對煙草花葉病均有一定的保護(hù)作用，其中，商陸和梔子表現(xiàn)的保護(hù)作用較明顯，在接種病毒液14 d后，防治效果分別達(dá)到75.23%、74.33%。病情指數(shù)和防治效果都存在時間效應(yīng)，隨時間的遞增病情指數(shù)上升，防治效果下降。

植物提取物對煙草花葉病的治療作用，結(jié)果見表4。

表4 植物提物對煙草花葉病的治療作用Table4 Remedial effect of plant extracts on TMV disease

從表4可以看出，植物提取物對煙草花葉病有一定的治療作用，防治效果明顯好于保護(hù)作用。其中，噴灑銀杏提取物的煙草植株在接種病毒液14 d后的治療效果可達(dá)93.59%。

3 討 論

本試驗(yàn)研究表明，供試的 24種植物提取物對TMV均具有一定的鈍化作用，對TMV初侵染抑制效果略差。其中以銀杏、梔子、商陸、赤芍等植物提取物的效果較好，其體外鈍化效果明顯高于TMV初侵染的抑制作用。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)也表明，以銀杏、梔子、商陸、赤芍等植物提取物對煙草花葉病的保護(hù)和治療效果比較明顯。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，銀杏、梔子、商陸、赤芍等提取物對煙草花葉病毒（TMV）具有明顯的抑制作用。

面對日趨嚴(yán)重的煙草花葉病帶來的危害，抗病毒藥劑的研發(fā)面臨新挑戰(zhàn)，從目前發(fā)展情況來看，運(yùn)用基因工程技術(shù)開發(fā)轉(zhuǎn)基因抗病品種、弱毒疫苗等仍不成熟，且存在一定爭議。而傳統(tǒng)的抗病毒制劑往往對植物有毒害、高副作用。植物提取物抗病毒的效果已經(jīng)大部分研究證實(shí)，植物提取物治療效果不亞于化學(xué)合成制劑，一般不會造成環(huán)境污染和殘留毒性問題，具有廣闊的發(fā)展前景[14]。如果能在研究單一植物提取物對煙草花葉病毒（TMV）抑制作用的基礎(chǔ)上，深入分析其抗病毒有效成分，并運(yùn)用中藥復(fù)方理論，對效果較好的植物提取物按比例進(jìn)行復(fù)配，開發(fā)出更穩(wěn)定、高效、可供農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上實(shí)際應(yīng)用的植物源農(nóng)藥，那其應(yīng)用前景就更廣闊，使用價值就更加巨大。

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