適于魷魚肌肉組織中菌群特征分析的PCR-DGGE方法的建立

鄧弘毅，王 月，丁林賢，王建玲，金 楊

(1.臺(tái)州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 臺(tái)州 318000;2.浙江師范大學(xué)，浙江 金華 321004)

魷魚，屬軟體動(dòng)物的門頭足綱，其肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味與鮑魚類似，國外有將魷魚加工成類似鮑魚的罐頭出售，因此魷魚又被冠以“窮人的鮑魚”的美稱，是廣受歡迎的水產(chǎn)品之一［1］。但由于其水分含量高，蛋白質(zhì)豐富，微生物含量較多，特別容易腐敗變質(zhì)，因此會(huì)引發(fā)一系列食品安全問題。目前關(guān)于食品中菌群特征方面的研究，國內(nèi)外已有不少報(bào)道，但許多研究仍停留在傳統(tǒng)的微生物鑒定法。由于自然界中有85%～99%的微生物至今還不可培養(yǎng)，因此傳統(tǒng)的微生物鑒定法具有一定的局限性［2］。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)手段被引入到食品微生物學(xué)的研究中。其中，基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)發(fā)展起來的PCR-變性梯度凝膠電泳 (DGGE)指紋分析技術(shù)就是一種可以有效避開微生物的分離培養(yǎng)階段，直接從食品中提取總DNA，揭示樣品中的微生物組成和動(dòng)態(tài)變化的方法。

該方法首先由 Fischer等［3］于 1979年提出，1985年 Myers等［4］首次在 DGGE中使用 “GC夾板”和異源雙鏈技術(shù)，使該技術(shù)日臻完善。目前，PCR-DGGE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物的微生物生態(tài)和種群群落的研究，并在食品領(lǐng)域尤其在水產(chǎn)品保鮮及加工中得到了一定的應(yīng)用。如Hovda等［5］利用該技術(shù)對(duì)氣調(diào)包裝大馬哈魚中的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)以及改良的氣調(diào)包裝大馬哈魚中的優(yōu)勢(shì)菌群為磷發(fā)光桿菌、熱殺索氏菌和假單胞菌屬。Yoshikawa等［6］對(duì)大馬哈魚子醬發(fā)酵過程中的菌群情況研究時(shí)發(fā)現(xiàn)耐鹽性酵母菌、假絲酵母等4種真菌是大馬哈魚子醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌群。

進(jìn)行DGGE分析的首要問題就是樣品中總細(xì)菌DNA的提取。作者以凍融法、勻漿法和搖床法3種方法處理魷魚樣本，采用SDS法結(jié)合蛋白酶K法直接對(duì)魷魚組織中的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行提取，建立了一套適合魷魚組織中菌落結(jié)構(gòu)分析的方法，為進(jìn)一步研究魷魚腐敗機(jī)理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮魷魚為購自金華市果蔬水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)的冰鮮魷魚，無菌水洗滌，室溫放置至出現(xiàn)輕度腐敗味時(shí)進(jìn)行取樣分析。

1.2 魷魚肌肉組織中細(xì)菌總DNA的提取

在無菌操作條件下將魷魚肌肉組織剪碎，稱取6份10 g樣品，采用凍融法、搖床法和勻漿法進(jìn)行前處理，各方法均重復(fù)2次［7］。

1.2.1 凍融法

取10 g樣品置于無菌離心管中，液氮處理2min后放于65℃水浴中保溫至完全融化，反復(fù)凍融3次。將樣品轉(zhuǎn)移至無菌錐形瓶中，加入90mL無菌TE緩沖液，充分搖勻，靜置5min，取上清液50mL，10000 r·min-1離心10min，待用。

1.2.2 勻漿法

取10 g樣品置于無菌玻璃勻漿器中充分勻漿后轉(zhuǎn)移至無菌錐形瓶中，加入90mL無菌TE緩沖液，充分搖勻，靜置 5min，取上清液 50mL，10000 r·min-1離心 10min，待用。

1.2.3 搖床法

取10 g樣品置于無菌錐形瓶中，加入10 g無菌玻璃珠和90mL無菌TE緩沖液，200 r·min-1、4℃振蕩處理30min，靜置5min，取上清液50mL，10000 r·min-1離心 10min，待用。

1.2.4 細(xì)菌總DNA的提取

3種處理后所得沉淀用10mL TE懸浮，加入0.5mL 10%SDS，50μL蛋白酶 K，混勻，37℃孵育 1 h。加入 1.5mL 5 mol·L-1NaCl，1.5mL CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃孵育20min。用等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，10000 r·min-1離心10min取上清，重復(fù)上述操作直至兩相交界面無白色物質(zhì)出現(xiàn)為止。取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，10000 r·min-1離心 10min。取上清，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h，10000 r·min-1離心15min得到DNA沉淀。加入 700μL 75% 乙醇，70μL 3mmol NaAc漂洗 DNA沉淀后，溶解于1mL TE，-20℃保存。

1.3 16 S rDNA的PCR-DGGE圖譜的構(gòu)建

1.3.1 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

DNA用無菌水分別連續(xù)作3倍梯度稀釋，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR引物:8 F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3’)和 1510 R(5’-GGCTACCTTGTTACGA-3’)。

PCR反應(yīng)體系:Primer 1μL，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，dNTP Mixture 5.0μL， DNA 1.0μL，TaKaRa Ex Taq 0.3μL 和 ddH2O 37.7μL。

PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性2min;94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸2min。

1.3.2 16 S rDNA V3區(qū)片段的PCR擴(kuò)增

PCR 引 物:GC357F(5’-CGCCCGCCGCG CGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGCCACCTACG GGAGGCAGCAG-3’) 和 517 R(5’-ATTACCGC GGCTGCTGG-3’)。

PCR反應(yīng)體系:Primer 1μL，2×GC Buffer II 25.0μL，dNTP Mixture 8.0μL， DNA 1.0μL，TaKaRa La Taq 0.5μL 和 ddH2O 14.5μL。

PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，55℃退火 1min，72℃延伸 1.5min，305個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5min。

1.3.3 DGGE圖譜的建立與分析

DGGE電泳采用 Muyzer等［8］的方法，電泳條件為恒溫60℃，電壓85 V，聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，電泳時(shí)間14 h。電泳結(jié)束后，EB染液浸染15min，再用ddH2O漂洗5min，UVP凝膠成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 魷魚肌肉組織細(xì)菌總DNA的提取

魷魚樣品采用3種不同前處理后所提取的細(xì)菌總DNA電泳圖如圖1所示，結(jié)果表明經(jīng)3種前處理方法后均能成功提取魷魚肌肉組織細(xì)菌的總DNA。其中，勻漿處理較其他2種處理所得DNA電泳條帶要亮很多，說明勻漿處理提取DNA的產(chǎn)率最高。搖床處理次之，凍融處理提取DNA的產(chǎn)率最低。

圖1 魷魚肌肉組織細(xì)菌總DNA提取電泳圖

2.2 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

以提取的魷魚肌肉組織細(xì)菌總DNA及其相應(yīng)的稀釋梯度為模板，以8 F和1510 R為引物進(jìn)行第1套PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，所得產(chǎn)物是大小約1500 bp的16 S rDNA片段，且隨著稀釋梯度的加大，條帶亮度先增強(qiáng)后減弱。

2.3 細(xì)菌16 S rDNA V3區(qū)片段的PCR擴(kuò)增

圖2 1500 bp 16 S rDNA片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以第1套PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以GC357 F和517 R為引物進(jìn)行第2套PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，所得產(chǎn)物是大小約160 bp的片段。

圖3 細(xì)菌16 S rDNA V3區(qū)片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 DGGE圖譜的建立

用第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在變性梯度30%～60%進(jìn)行DGGE電泳，結(jié)果如圖4。由圖4可知，DGGE共分離產(chǎn)生5條較明顯的條帶，3種方法所得圖譜均相似，且都存在明顯的主次帶之分。

圖4 細(xì)菌16 S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜

3 小結(jié)與討論

PCR-DGGE方法避開了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離的環(huán)節(jié)，直接提取微生物總DNA，獲得種群的DNA信息，較為真實(shí)地揭示樣品中微生物的實(shí)際組成，理論上只要實(shí)驗(yàn)條件適當(dāng)，DGGE技術(shù)便可區(qū)分1個(gè)堿基差別的DNA片段［9］。但是，如何從樣品中直接提取微生物總DNA，這是DGGE分析首先要解決的問題，可以說高質(zhì)量和高產(chǎn)量的基因組DNA的提取是PCR-DGGE分析的前提和基礎(chǔ)。一般來說，直接從魷魚組織中提取細(xì)菌DNA需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。前處理方法的不同可能會(huì)影響DNA提取的效果及后續(xù)的PCR擴(kuò)增和DGGE分析。凍融法、勻漿法和搖床法3種前處理對(duì)魷魚組織中細(xì)菌DNA的提取效果及對(duì)DGGE分析影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，勻漿處理提取DNA的產(chǎn)率最高，搖床處理次之，凍融處理最低。PCR-DGGE分析表明3種前處理形成的條帶分布相似，且都存在明顯的主次帶之分，說明這3種前處理對(duì)后續(xù)PCR-DGGE分析的影響無明顯差異。但是，就具體試驗(yàn)來說，搖床法和凍融法分別采用無菌錐形瓶和無菌離心管，所以能同時(shí)處理多個(gè)樣本，而勻漿法在處理每一個(gè)樣品時(shí)需對(duì)勻漿器進(jìn)行滅菌，故該方法不適于處理大量樣本。

魷魚是一類蛋白質(zhì)含量豐富的水產(chǎn)品，100 g魷魚鮮品中的蛋白質(zhì)含量就高達(dá)16～18 g［10］，雜蛋白一方面會(huì)影響DNA的溶解，另一方面也會(huì)干擾后續(xù)的PCR反應(yīng)，因此盡可能的去除雜蛋白也是建立適于魷魚組織的DGGE分析方法的關(guān)鍵問題。一般來說，為獲取高純度的DNA樣本都需要對(duì)DNA樣本進(jìn)行純化，但是常用的DNA純化方法容易導(dǎo)致DNA樣本的嚴(yán)重?fù)p失，最終導(dǎo)致微生物多樣性的下降。本試驗(yàn)通過簡單的提高抽提次數(shù)并結(jié)合DNA稀釋法，降低雜質(zhì)在DNA模板中的濃度，獲得了高質(zhì)量的DNA樣本，直接用于PCR擴(kuò)增，有效避開了DNA純化步驟，在很大程度上避免了DNA樣本的流失，更為真實(shí)地反映待測(cè)樣品中微生物的菌群特征。

［1］吳少杰，張俊杰，姚興存，等.我國魷魚的綜合加工利用現(xiàn)狀與展望 ［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32(1):154-156.

［2］辜運(yùn)富，張小平，涂仕華.變性梯度凝膠電泳 (DGGE)技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用 ［J］.土壤，2008，40(3):344-350.

［3］Fischer S G，Lerman L S.DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels:correspondence with melting theory ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1983，80(6):1579-1583.

［4］Myers R M，F(xiàn)ischer S G，Lerman L S，et al.Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Nucleic Acids Research，1985，13(9):3131-3145.

［5］Hovda M B， Sivertsvik M， Lunestad B T， et al.Characterisation of the dominant bacterial population in modified atmosphere packaged farmed halibut (Hippoglossus hippoglossus)basedon 16SrDNA-DGGE ［J］.Food Microbiology，2007，24(4):362-371.

［6］Yoshikawa S，Yasokawa D，Nagashima K，et al.Microbiota during fermentation of chum salmon(Oncorhynchus keta)sauce mash inoculated with halotolerant microbial starters:analyses using the plate count method and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) ［J］.Food Microbiology，2010，27(4):509-514.

［7］江蕓，高峰，徐幸蓮，等.冷卻豬肉不同前處理對(duì)細(xì)菌DNA提取及PCR-DGGE的影響 ［J］.食品科學(xué)，2010，31(6):258-262.

［8］Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbialpopulations by denaturing gradientgel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700.

［9］Amann R I， Ludwig W， SchleiferK H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation ［J］.Microbiological Reviews，1995，59(1):143-169.

［10］陳意.魷魚的營養(yǎng)及食用價(jià)值 ［J］.食品與藥品，2006，8(6):75.