氣管滴注納米二氧化硅顆粒致大鼠肺炎癥反應及臟器中硅濃度變化的研究

崔冠群，杜忠君，高 靜，侯松萍＊

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院a.呼吸內(nèi)科；b.老年病科，吉林 長春130033；2.山東省醫(yī)學科學院山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院，山東 濟南250002）

隨著科技的發(fā)展，生活中納米產(chǎn)品的應用越來越多，環(huán)境中特別是職業(yè)環(huán)境懸浮大量的納米顆粒物，呼吸道無疑是納米顆粒進入人體的主要途徑。張婷等［1］發(fā)現(xiàn)，納米顆?？沙练e在動物的呼吸道各級支氣管及肺泡內(nèi)，即使吸入較低濃度的納米顆粒，但因其粒徑極小、數(shù)量大，也會對呼吸道產(chǎn)生明顯的生物學效應，從而為納米顆粒致肺臟損傷提供了可能。流行病研究也表明空氣中的超細顆粒物是呼吸系統(tǒng)疾病入院率和死亡率增高的危險因素，且危害與顆粒物粒徑相關，納米顆粒對呼吸系統(tǒng)的影響不容忽視［2］。

納米二氧化硅作為一種非金屬氧化物，是當前世界最常用的工程化納米材料，被廣泛應用于材料、化工及生物醫(yī)藥等領域［3－5］。納米二氧化硅顆?？梢酝ㄟ^呼吸道，皮膚接觸，食物攝入以及醫(yī)學靜注等方式進入人體，而研究者認為呼吸道是人群暴露納米顆粒的主要進入途徑［6，7］。因此，肺臟就成為納米二氧化硅顆粒作用的最直接、最主要的靶器官。納米二氧化硅顆粒的肺毒理學研究也成為當前的研究熱點，但目前實驗數(shù)據(jù)較少，機制尚未明確，所得的研究結(jié)論也未完全一致。而且近年來的研究主要集中在納米尺度與常規(guī)尺度的顆粒的急性毒性的比較研究［8－10］，關于納米二氧化硅顆粒對肺組織的時間效應報道較少，本研究采用非暴露式氣管滴注30 nm二氧化硅顆粒染毒雄性Wistar大鼠，觀察不同時間納米二氧化硅顆粒可能產(chǎn)生的肺臟炎癥反應。以便為納米材料吸入機體后致肺臟毒性評價提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 無定形納米二氧化硅顆粒（30 nm）由吉林大學化學學院提供；透射電子顯微鏡（JEM－2010，日本JEOL公司）；粒度分析儀（Nano ZS90，英國 Malvern公司）；Scintag XRD－2000衍射儀（美國Scintag，Inc.Cupertino，CA）；電感耦合等離 子體質(zhì) 譜 （美國 PerKin－Elmer，Wellesley，MA）；電感耦合等離子體發(fā)射光譜（美國PerKin－Elmer，Wellesley，MA）；全自動生化分析儀（TBA－200FR，日本Toshiba Medical Systems公司）；全自動紅細胞分析儀（XT－2000iV，日本Toshiba Medical Systems公司）；UV－752紫外分光光度計（中國棱光公司）；光學顯微鏡（DM4000M，德國Leica公司）；透射電子顯微鏡（JEM－100CXⅡ，日本JEOL公司）；微波消解儀（MDS－6，意大利 Milestone公司）。

1.2 實驗動物分組及染毒

128只健康雄性SPF級 Wistar大鼠，購自吉林大學白求恩醫(yī)學部實驗動物中心，體重在180－210g，動物房合格證書號：SYXK （Ji）2007－0011，大鼠購入后在SPF級飼養(yǎng)室內(nèi)適應性喂養(yǎng)一周，飼養(yǎng)溫度為18－24℃，相對濕度為45%，晝夜循環(huán)節(jié)律：12h：12h；動物實驗全部遵循吉林大學白求恩醫(yī)學部倫理委員會的評估和批準協(xié)議。實驗設空白對照組及實驗組（0.5、1及2mg／Kg·bw），每個劑量組含有32只大鼠，采用氣管滴注法一次染毒，滴注體積為0.2ml；連續(xù)觀察染毒后1d、7d、14d以及28d大鼠的情況。

1.3 表征納米二氧化硅顆粒

采用透射電子顯微鏡測定粒子的粒徑及分布；采用Scintag衍射儀表征粒子的晶體結(jié)構(gòu)；采用ICP－MS檢測納米二氧化硅顆粒中的金屬雜質(zhì)。

1.4 大鼠臟器中Si含量的測定

染毒后不同時間點，處死大鼠，準確稱量心、肝、脾、肺、腎、腦各0.4g，微波消解30分鐘，采用ICPOES測量不同時間點各臟器中的Si含量。

1.5 肺泡灌洗液的制備及其指標的檢測

染毒各個時間點后，用鑷子固定結(jié)扎左肺，首先用3ml預熱的生理鹽水（37℃）灌洗右肺，得到的肺泡灌洗液（BALF）4℃、2 200rpm離心10min，上清液用來進行生物化學檢測；然后再用2ml預熱的生理鹽水灌洗右肺2次，分別按照以上條件離心獲得BALF，收集離心后的沉淀細胞進行細胞計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納米二氧化硅顆粒的表征

如圖1與表1所示，通過透射電鏡觀察，納米二氧化硅顆粒呈橢球型，平均粒徑在27.26±4.92 nm，并呈現(xiàn)輕微的聚合現(xiàn)象，這可能與顆粒的高表面活性有關。水合粒徑與比表面積分別為71.43 nm和158.02m2／g；并且本研究所用顆粒經(jīng)ICPMS檢測，純度高達99.8%，符合本實驗的要求。

圖1 無定形納米二氧化硅顆粒的電鏡圖片

表1 Characterization of silica particles

2.2 組織中的硅濃度改變

大鼠氣管滴注納米二氧化硅顆粒后，不同時間點各臟器中硅濃度如圖2所示，與對照組相比較，滴注后的四個時間點，每個暴露組的肺臟、肝臟、腎臟中的Si含量均顯著升高，（P均＜0.05）。脾臟中的硅含量，2mg／Kg·bw暴露組在滴注后四個時間點，1mg／Kg·bw暴露組在滴注后7、14以及28天后均顯著升高，（P均＜0.05）。各個暴露組心和腦中的硅含量雖然隨著時間和劑量的增加有升高趨勢，但（P 均＞0.05）。

圖2 氣管滴注納米二氧化硅顆粒后大鼠各組織中的硅濃度

2.3 肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)及生物化學的變化

圖3 肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)及生物化學分析

肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)如圖3A所示，每個時間點的1、2mg／Kg·bw暴露組以及滴注后14及28天的0.5mg／Kg·bw暴露組的白細胞總數(shù)明顯高于各自的空白對照組（P＜0.05），并且肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。每個觀察時間點的2mg／Kg·bw暴露組，暴露后1及7天的0.5mg／Kg·bw暴露組以及暴露后1、7及14天的1mg／Kg·bw暴露組的蛋白含量明顯高于各自觀察時間點的對照組（P＜0.05）（圖3B）。每個觀察時間點的0.5、1和2mg／Kg·bw暴露組的LDH活性顯著高于其對照組（P＜0.05）（圖3C）。

3 討論

本研究用Wistar大鼠制作動物模型，以生理鹽水作為空白對照，采用非暴露式氣管滴注方式進行染毒，本方法簡便，容易掌握，便于控制染毒濃度，在熟練操作的前提下，安全有效，因此該染毒方式是研究顆粒物急性、亞急性毒性效應較佳的選擇。肺泡灌洗液中含有肺臟的游離細胞，從肺泡中分泌和滲出以及從血管滲出的各種生化成分，因此，肺泡灌洗液中的成分變化可迅速，定量的反映吸入的顆粒物對肺臟的損傷程度。所以，本實驗中主要采用分析肺泡灌洗液中的成分變化來研究納米二氧化硅顆粒對Wistar大鼠的肺損傷作用。

流行病學研究顯示，肺內(nèi)顆粒負荷與肺纖維化和肺損傷密切相關，并且呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生率與空氣中的單位體積超細顆粒物的數(shù)目密切相關［11］。滯留在肺內(nèi)的二氧化硅顆粒含量及時間與肺纖維化的病理分級之間呈相關性［12］。本研究結(jié)果顯示，各暴露組隨著時間延長，肺組織內(nèi)的硅含量有下降趨勢，但肺組織內(nèi)的硅含量降低幅度較小，并且，其可能主要通過“血－支氣管肺泡屏障”進入循環(huán)系統(tǒng)，再分布到其他組織器官。肝臟、腎臟以及脾臟是納米二氧化硅顆粒再分布的主要器官，心臟和腦中的硅含量也有增加，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。因此，本研究推測吸入進入機體的納米二氧化硅顆粒主要作用于機體的肝臟、腎臟以及脾臟，并且進入臟器的納米顆粒，很難隨著時間的推移而從該器官排除，從而更易引起組織器官的損傷。

肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)是炎癥反應程度的一種指標［13，14］。本研究中，除0.5mg／Kg·bw 暴露組在暴露1和7天后肺泡灌洗液中的白細胞總數(shù)與對照組無顯著差異之外，該劑量暴露14和28天以及1和2mg／Kg·bw暴露組在各個時間點的白細胞總數(shù)均顯著高于對照組。肺泡灌洗液中的蛋白主要來自于血漿的滲出，正常肺組織的肺泡膜和肺毛細血管膜可以阻止白蛋白的通過。因此，肺泡灌洗液中的蛋白含量的升高反映了肺泡上皮－毛細血管屏障的損傷程度［15］。本研究結(jié)果顯示蛋白含量的升高提示即使是在暴露后最長的時間點，肺泡灌洗液中的蛋白含量明顯高于其對照組，表明肺組織仍存在一定程度的損傷性改變，并且，本研究結(jié)果還顯示納米二氧化硅顆粒暴露劑量越大，肺組織損傷越嚴重、修復所需時間越長。乳酸脫氫酶活性是一種反應顆粒暴露后引起動物肺臟細胞毒性損傷程度的標志物［16］，本研究結(jié)果顯示納米二氧化硅顆粒暴露組肺泡灌洗液中的乳酸脫氫酶活性顯著高于同時間點的對照組，并且，二氧化硅顆粒暴露劑量越大，肺組織細胞毒性反應程度越大?？傊?，本研究結(jié)果顯示，氣管暴露納米二氧化硅顆粒后，大鼠肺泡灌洗液中的蛋白含量、乳酸脫氫酶值均升高，提示大鼠暴露納米二氧化硅顆粒后可引起肺實質(zhì)細胞損傷，血管通透性增加，對大鼠肺臟產(chǎn)生了一定的毒性作用，并且具有一定的劑量效應關系。

本研究對氣管滴注納米二氧化硅顆粒致大鼠肺臟損傷進行了初步探討，分別檢測主要臟器中的硅濃度變化，肺泡灌洗液中肺部炎癥指標隨時間的變化而改變情況，為納米材料對肺損傷影響提供了一定的理論依據(jù)和線索，關于納米二氧化硅顆粒對機體影響的具體機制還有待進一步的研究。

［1］張 婷，唐 萌.納米顆粒吸入毒性研究進展 ［J］.衛(wèi)生研究，2008，37（5）：633.

［2］Oberdorster G，F(xiàn)efin J，Lehnert BE.Correlation between particle size，in vivo particle persistence，and lung injury ［J］.Environ Health Perspect，1994，102（Suppl 5）：173.

［3］Burns AA，Vier J，OW H，et al.Fluoreseeni Silica Nanoparticles with Emcient Urinary Excretion for Nanomedieine ［J］.Nano Lett，2009，9（1）：442.

［4］Sayescm，Warheitdb.Charaeterization of nanomaterials for toxieity assessment［J］.Nanomed Nano－bioteehnol，2009，1（6）：660.

［5］Murdock RC，Braydich－stoll EL，Scharand AM，et al.Characterization of nanomateriald is persioninsolution priortoin vitro exposure using dynamic light scattering technique［J］.Toxicol Sci，2008.101（2）：239.

［6］Li Y，Sun L，Sun ZW，et al.Size－dependent cytotoxicity of amorphous silica nanoparticles in human hepatomaHepG2cells［J］.Toxicology in Vitro，2011，25（7）：1343.

［7］Oberdorster G，Oberdorster E，Oberdorster J，et al.Nanotoxicology：An emergingdiscipline evolving from studies of ultrafine particles［J］.Environ Health Perspect，2005，113（7）：823.

［8］Goman J.Taming high－tech partieles［J］.Science News，2002，161（13）：200.

［9］Shvedova AA，Kisin ER，Mercer R，et al.Unusnal inflammatory and fibrogenic pulmonary responses to single－walled carbon nanotubes in mice［J］.Physieo lLung Cell Mol Pgysiol，2005，289（5）：698.

［10］Hnizdo E，Vallyathan V.Chronic obstructive pulmonary disease due to occupational exposure to silica dust：a review of epidemiological and pathological evidence［J］.VMJ，2003，60（4）：237.

［11］Boschetto P，Quintavalle S，Miotto D，et al.Chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and occupational exposures［J］.J Occup Med Toxieol，2006，l（1）：11.

［12］Nagelschmidt G.The relation between lung dust and lung pathology in pneumoconiosis［J］.Br Med J，1960，247.

［13］Shvedova AA，Kisin E，Murray AR，et al.Inhalation vs.aspiration of single－walled carbon nanotubes in C57BL／6mice：inflammation，fibrosis，oxidative stress，and mutagenesis ［J］.Am J Physiol，2008，295：1.

［14］Warheit DB，Webb TR，Reed KL，et al.Pulmonary toxicity study in rats with three forms of ultrafine－TiO2particles：differential responses related to surface properties［J］.Toxicology，2007，230：90.

［15］Muller J，Huaux F，Moreau N，et al.Respiratory toxicity of multi－wall carbon nanotubes［J］.Toxicol Appl Pharm，2005，207：221.

［16］Chung YJ，Coates NH，Viana ME，et al.Dose－dependent allergic responses to an extract of Penicillium chrysogenum in BALB／c mice［J］.Toxicology，2005，209（1）：77.