桂枝湯類(lèi)方主要成分在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)比較研究

陳瑩蓉， 高成璐， 裘福榮， 馬越鳴*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

桂枝湯類(lèi)方主要成分在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)比較研究

陳瑩蓉1， 高成璐2， 裘福榮2， 馬越鳴1*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

目的 比較桂枝湯類(lèi)方不同配伍大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)差異。方法 LC-MS/MS法分析大鼠灌服桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后在大鼠體內(nèi)的桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異，以及配伍對(duì)芍藥苷腸菌代謝的影響。結(jié)果 大鼠灌服桂枝湯類(lèi)方血漿中桂皮酸、馬尿酸及甘草次酸的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)劑量校正后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但桂枝加芍藥湯中芍藥苷的Cmax升高 （P＜0.05）。大鼠灌胃芍藥苷后其AUC和Cmax與給藥劑量呈線性關(guān)系。配伍甘草對(duì)芍藥苷腸菌代謝的抑制作用最強(qiáng)。結(jié)論 桂枝湯類(lèi)方的不同配伍對(duì)芍藥苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)有影響，其機(jī)理可能是抑制了芍藥苷的腸菌代謝。

桂枝湯類(lèi)方；LC-MS/MS；藥代動(dòng)力學(xué)；配伍；芍藥苷；腸菌代謝

桂枝湯類(lèi)方出自《傷寒論》，桂枝湯為基本方，由桂枝、芍藥、甘草、生姜和大棗組成，具有解肌發(fā)表，調(diào)和營(yíng)衛(wèi)之功效，主治外感風(fēng)寒表虛證，對(duì)體溫、血壓、腸蠕動(dòng)和免疫功能等有雙向調(diào)節(jié)作用［1］，現(xiàn)代臨床用于治療感冒等［2］；桂枝加桂湯為桂枝湯中桂枝劑量增加獲得，具有溫陽(yáng)祛寒，平?jīng)_降逆之功效，是治療“奔豚證”的方劑，現(xiàn)代臨床用于治療高血壓、美尼爾氏綜合征、充血性心力衰竭等［3］；桂枝加芍藥湯為桂枝湯中芍藥劑量加倍獲得，具有溫脾和中，緩急止痛之功效，主治太陽(yáng)病誤下傷中，土虛木乘之腹痛，現(xiàn)代臨床用于治療黏連性腸梗阻、腸易激綜合征等［4］。

桂枝湯類(lèi)方的藥味組成相同，配比不同，其功效和主治有一定的區(qū)別；桂枝和芍藥配比的變化是否會(huì)引起3個(gè)方劑中主要成分體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的差異，藥動(dòng)學(xué)過(guò)程的差異與功效與主治變化的關(guān)系如何，這幾個(gè)問(wèn)題都有待解決。目前對(duì)桂枝湯類(lèi)方的藥代動(dòng)力學(xué)方面尚未見(jiàn)研究報(bào)道，未從藥動(dòng)學(xué)方面闡明其體內(nèi)配伍規(guī)律和組方原理，故有必要對(duì)這3個(gè)復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行比較研究。桂皮酸是桂枝的主要入血成分［5］，馬尿酸是桂皮酸的代謝產(chǎn)物，芍藥苷是芍藥的主要成分［6-7］，甘草次酸是甘草的主要吸收形式，也是甘草的主要活性成分［8］。本研究采用LC-MS/MS法測(cè)定大鼠灌胃給予桂枝湯類(lèi)方后體內(nèi)主要成分桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸血藥濃度的經(jīng)時(shí)變化，并比較不同配伍中各成分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異，闡明桂枝湯類(lèi)方的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律和配伍影響，并進(jìn)一步探討配伍影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 桂皮酸 （純度99%）、芍藥苷（純度99%）、甘草次酸 （純度98%）和內(nèi)標(biāo)地西泮 （純度98%）對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；馬尿酸 （純度98%）、內(nèi)標(biāo)1，8-二羥基蒽醌（純度98%）對(duì)照品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；90%芍藥苷購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。桂枝、芍藥、甘草、大棗和生姜均購(gòu)自上海同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室趙志禮教授鑒定為正品藥材。甲醇為色譜純 （Merck），其余試劑為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水 （Millipore制備）。正常腸菌孵育液為自制（取正常大鼠新鮮糞便4 g，加入?yún)捬跖囵B(yǎng)液［9］40 mL，攪勻后3 000 r/min離心10 min，上清即為正常腸菌孵育液）。

1.2 儀器 LC-MS/MS系統(tǒng)，包括Agilent HPLC系統(tǒng)及串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)API4000（AB公司，USA），工作軟件為Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；TurboVap LV氮吹儀 （Caliper Life sciences）；USC-502超聲波清洗器 （上海波龍電子設(shè)備有限公司）；TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 桂枝湯類(lèi)方提取物的制備 桂枝和生姜分別用加5倍量水用蒸餾法提取2 h，收集揮發(fā)油，藥渣與芍藥、甘草和大棗按比例 （桂枝湯中桂枝9 g，芍藥9 g，甘草6 g，生姜9 g，大棗12枚；桂枝加桂湯中桂枝為15 g；桂枝加芍藥湯中芍藥為18 g，其余四味藥劑量不變）用10倍量水煎煮1 h，再用8倍量水煎煮1 h，濃縮，干燥，制成桂枝湯類(lèi)方提取物細(xì)粉。桂枝用蒸餾法提取得揮發(fā)油后再用水煎煮，濃縮，干燥，制成提取物細(xì)粉，芍藥和甘草直接用水煎煮，濃縮，干燥，制成提取物細(xì)粉。桂枝湯類(lèi)方中各成分的量由HPLC法測(cè)得［10］。將桂枝和生姜揮發(fā)油按桂枝和生姜生藥在桂枝湯類(lèi)方中所占比例加入桂枝湯類(lèi)方提取物細(xì)粉，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解得桂枝湯類(lèi)方給藥藥液。

1.4 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠36只，（230±10）g，雌雄各半，合格證號(hào)：SCXK 2008-0016，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.5 桂枝湯類(lèi)方主要成分藥代動(dòng)力學(xué)比較

1.5.1 LC-MS/MS條件 Agilent TC-C18色譜柱 （5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為A（0.08%甲酸4 mmol/L醋酸銨）和B（甲醇），梯度洗脫：0→10 min，60%B→90%B，10→19 min，90%B；體積流量0.6 mL/min；柱溫30℃。采用正負(fù)離子模式檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 （MRM）測(cè)定，正離子模式檢測(cè)甘草次酸，負(fù)離子模式檢測(cè)桂皮酸、馬尿酸和芍藥苷，正離子內(nèi)標(biāo)為地西泮，負(fù)離子內(nèi)標(biāo)為1，8-二羥基蒽醌。

1.5.2 血漿樣品處理方法 血漿50 μL，加入內(nèi)標(biāo)120 ng/mL 地西泮、3 μg/mL 1，8-二羥基蒽醌各5 μL，加入1 mol/L 鹽酸15 μL，渦旋1 min，加入乙 酸 乙 酯 0.25 mL，渦 旋 2 min，離 心（16 000 r/min）10 min，吸取上清液吹干，殘?jiān)?0μL 流 動(dòng) 相 復(fù) 溶，渦 旋 1 min，離 心（16 000 r/min）10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

1.5.3 方法學(xué)考察 血漿中內(nèi)源性成分不干擾各給藥組中待測(cè)成分的檢測(cè)?？瞻籽獫{中在與馬尿酸對(duì)照品相同保留時(shí)間處有檢出質(zhì)譜峰，經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定，判斷該成分即為血漿中內(nèi)源性的馬尿酸。又經(jīng)多份空白血漿樣品測(cè)定，該峰每份空白血漿樣品的峰面積相對(duì)小而恒定，在馬尿酸最低定量限的20%以內(nèi)，故不影響馬尿酸的檢測(cè)。

用加權(quán)最小二乘法 （w=1/c2）進(jìn)行線性回歸運(yùn)算求得桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，各成分低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的批內(nèi)、批間精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性均符合生物樣品分析要求。

1.5.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) SD大鼠18只隨機(jī)分為3組，每組單次灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯 （桂枝湯類(lèi)方給藥劑量見(jiàn)表1）。分別在灌胃后的0.017、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h于眼球后靜脈叢采血，肝素抗凝，9 600 r/min，4℃下離心制備血漿，血漿保存在－70℃中待測(cè)。血漿中各成分的質(zhì)量濃度按上述方法進(jìn)行測(cè)定，超出定量限的樣品用空白血漿稀釋后再檢測(cè)。

表1 桂枝湯類(lèi)方給藥劑量Tab.1 Doses of three extracts given in three treatment groups

1.6 芍藥苷單體藥代動(dòng)力學(xué) SD大鼠18只隨機(jī)分為芍藥苷低、中、高3個(gè)劑量組，每組單次灌胃給予90%芍藥苷11.1、22.2、44.4 mg/kg（分別含芍藥苷單體10，20，40 mg/kg）。分別在灌胃后的0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8和 12 h于眼球后靜脈叢采血，肝素抗凝，9 600 r/min，4℃下離心制備血漿，血漿保存在－70℃中待測(cè)。血漿中芍藥苷的質(zhì)量濃度按1.5項(xiàng)中的方法進(jìn)行測(cè)定，超出定量限的樣品用空白血漿稀釋后再檢測(cè)。

1.7 桂枝湯類(lèi)方和相應(yīng)的單味藥及其組合對(duì)芍藥苷腸菌代謝的影響

1.7.1 桂枝湯類(lèi)方對(duì)芍藥苷腸菌代謝的影響 將0.3 mL的芍藥苷單體、芍藥、桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯藥液加入2.7 mL的正常腸菌孵育液中，依次為芍藥苷單體組、芍藥組、桂枝湯組、桂枝加桂湯組和桂枝加芍藥湯組，每組重復(fù)3份，體系中芍藥苷單體組芍藥苷的終質(zhì)量濃度為46.2 μg/mL，芍藥組、桂枝湯、桂枝加桂湯組和桂枝加芍藥湯組提取物粉末的終質(zhì)量濃度為4.8、21.3、15.1和17.1 mg/mL（依次相當(dāng)于生藥20、97、111和104 mg/mL）。各組37℃水浴下0、8、10、12和24 h時(shí)取出0.2 mL孵育液，加入終止液0.2 mL終止反應(yīng)。將各組孵育體系終芍藥苷不同時(shí)間點(diǎn)的濃度以相對(duì)濃度形式表示 （芍藥苷相對(duì)濃度=實(shí)際濃度/零時(shí)濃度×100%）。

1.7.2 桂枝湯類(lèi)方中的單味藥及其組合對(duì)芍藥苷腸菌代謝的影響 將0.3 mL的腸菌緩沖液、桂枝、甘草和桂枝甘草藥液加入2.4 mL的正常腸菌孵育液中，依次為空白對(duì)照組、桂枝組、甘草組及桂枝甘草組，每組重復(fù)3份。各組37℃水浴下預(yù)孵育1 h后加入0.3 mL的芍藥藥液，體系中芍藥藥液的終質(zhì)量濃度為9.7 mg/mL（相當(dāng)于生藥40 mg/mL），桂枝、甘草及桂枝甘草的終質(zhì)量濃度為1.1、5.4、及6.5 mg/mL（依次相當(dāng)于生藥 20、13.3及 33.3 mg/mL）。各組37℃水浴下0、8、10、12、24 h時(shí)取出0.2 mL孵育液，加入甲醇0.2 mL終止反應(yīng)。將各組孵育體系終芍藥苷不同時(shí)間點(diǎn)的濃度以相對(duì)濃度形式表示 （芍藥苷相對(duì)濃度 =實(shí)際濃度/零時(shí)濃度×100%）。

1.8 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算血漿中桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸的濃度。由DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)，求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) （實(shí)測(cè)值）；為了消除給藥劑量不同所帶來(lái)的影響，將所有劑量相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行劑量校正 （AUC/dose及Cmax/dose）。芍藥苷腸菌代謝孵育液中芍藥苷的濃度通過(guò)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，計(jì)算不同配伍藥物組中芍藥苷的相對(duì)AUC（0－24）。結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示。用Power Model［11］評(píng)價(jià)芍藥苷單體藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC（0－∞）和Cmax與給藥劑量間的線性關(guān)系。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及腸菌代謝相對(duì)AUC（0－24）均采用單因素方差分析－SNK檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析由SPSS 12.0軟件進(jìn)行，P＜0.05被認(rèn)為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 桂枝湯類(lèi)方主要成分藥代動(dòng)力學(xué) 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中可檢測(cè)到桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸，血藥濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)圖1。在3個(gè)復(fù)方組中，桂皮酸均可迅速吸收進(jìn)入體內(nèi)，并代謝產(chǎn)生馬尿酸，1 min即可檢測(cè)到，并隨時(shí)間呈動(dòng)態(tài)變化，各組中桂皮酸的達(dá)峰時(shí)間為灌胃給藥后的1 min，血漿中的濃度在6 h（桂枝湯組）、8 h（桂枝加桂湯組）和4 h（桂枝加芍藥湯組）后低于最低定量限；馬尿酸于灌胃給藥后的15～30 min達(dá)峰，血漿中的濃度在24 h（桂枝湯組及桂枝加桂湯組）和12 h（桂枝加芍藥湯組）后低于最低定量限。各組中芍藥苷的達(dá)峰時(shí)間為15～60 min，血漿中的濃度在8 h后低于最低定量限。各組中甘草次酸的達(dá)峰時(shí)間為6～12 h，血漿中的濃度在48 h后低于最低定量限。

圖1 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸血藥濃度－時(shí)間曲線 （±s，n=6）Fig.1 Plasma concentration-time curves of cinnamic acid，hippuric acid，paeoniflorin and glycyrrhetic acid after ig administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

各組中桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2～5。在實(shí)測(cè)參數(shù)中，經(jīng)單因素方差分析－SNK檢驗(yàn)，與桂枝湯組和桂枝加芍藥湯組比較，桂枝加桂湯組桂皮酸的Cmax和AUC及馬尿酸的Cmax增高，但劑量校正后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與桂枝湯組及桂枝加桂湯組比較，桂枝加芍藥湯組中芍藥苷的Cmax升高，劑量校正后，與桂枝加桂湯組比仍升高。對(duì)于甘草次酸而言，各組間的參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中桂皮酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters of cinnamic acid after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

表2 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中桂皮酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters of cinnamic acid after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

注：與桂枝湯比，aP＜0.05，bP＜0.01；與桂枝加桂湯比，cP＜0.05，dP＜0.01；*實(shí)測(cè)值；#劑量校正值；

參數(shù) 單位 桂枝湯 桂枝加桂湯 桂枝加芍藥湯*AUC（0－t） μmol h/mL 0.047±0.014 0.115±0.047b 0.054±0.027d#AUC（0－t）/dose （μmolh/mL）/（mmol/kg） 0.22±0.07 0.34±0.13 0.27±0.11 T1/2 h 1.2±0.3 1.3±0.4 1.0±0.3 MRT（0－t） h 1.25±0.25 1.45±0.36 0.94±0.15 Tmax h 0.02±0.00 0.02±0.00 0.02±0.00 Cl/F L/（kg/h） 0.9±0.3 1.1±0.5 0.7±0.3 Vd/F L/kg 1.6±1.0 1.1±0.5 1.5±1.0*Cmax μmol/mL 0.06±0.034 0.18±0.047b 0.08±0.027d#Cmax/dose （μmol/mL）/（mmol/kg）0.29±0.16 0.51±0.14 0.39±0.14

2.2 芍藥苷單體的藥代動(dòng)力學(xué) 大鼠灌胃給予芍藥苷低、中、高三個(gè)劑量組后血漿濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。各組芍藥苷藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表6。經(jīng)單因素方差分析，高、中、低3個(gè)劑量組中芍藥苷的T1/2和CL的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Power Model的評(píng)價(jià)結(jié)果如下：Cmax的相關(guān)系數(shù)為0.975，90%置信區(qū)間為 （0.986，1.203），判斷區(qū)間為 （0.743，1.258）；AUC（0－∞）的相關(guān)系數(shù)為 0.980，90%置信區(qū)間為 （0.841，1.005），判斷區(qū)間為 （0.839，1.161）。Cmax和 AUC（0－∞）的置信區(qū)間均在判斷區(qū)間內(nèi)，在10～40 mg/kg的劑量范圍內(nèi)芍藥苷大鼠單次給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與劑量成線性關(guān)系。參數(shù) 單位 桂枝湯 桂枝加桂湯 桂枝加芍藥湯

表3 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中馬尿酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters of hippuric acid after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

表3 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中馬尿酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters of hippuric acid after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

注：與桂枝湯比，aP＜0.05，bP＜0.01；與桂枝加桂湯比，cP＜0.05，dP＜0.01；*實(shí)測(cè)值；#劑量校正值；

參數(shù) 單位 桂枝湯 桂枝加桂湯 桂枝加芍藥湯*AUC（0－t） μg h/mL 53±31 81±39 38±5#AUC（0－t）/dose （μg h/mL）/（mg/kg） 13.3±7.8 9.1±4.4 7.2±0.9 MRT（0－t） h 4.5±3.4 4.0±2.4 2.5±1.3 T1/2 h 2.8±2.0 2.2±1.4 2.0±1.2 Tmax h 0.50±0.27 0.29±0.10 0.25±0.00*Cmax μg/mL 17±3 36±7b 24±9d#Cmax/dose （μg/mL）/（mg/kg）4.2±0.7 4.0±0.8 4.5±1.7

表4 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中芍藥苷藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.4 Pharmacokinetic parameters of paeoniflorin after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

表4 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中芍藥苷藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.4 Pharmacokinetic parameters of paeoniflorin after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

注：與桂枝湯比，aP＜0.05，bP＜0.01；與桂枝加桂湯比，cP＜0.05，dP＜0.01；*實(shí)測(cè)值；#劑量校正值；

*AUC（0－t） μg h/mL 1.1±0.5 0.6±0.2 1.1±0.8#AUC（0－t）/dose （μg h/mL）/（mg/kg） 0.087±0.039 0.050±0.018 0.057±0.041 MRT（0－t） h 2.20±0.59 1.97±0.39 1.13±0.20bd T1/2 h 1.9±1.1 1.4±0.5 1.0±0.2 Tmax h 0.46±0.10 0.38±0.14 0.46±0.10 Cl/F L/kg/h 13±5 21±7 23±11 Vd/F L/kg 41±33 45±23 32±15*Cmax ng/mL 605±282 317±106 1 256±793ad#Cmax/dose （ng/mL）/（mg/kg） 50±23 26±9 63±40c

表5 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中甘草次酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.5 Pharmacokinetic parameters of glycyrrhetic acid after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

表5 大鼠灌胃給予桂枝湯、桂枝加桂湯和桂枝加芍藥湯后血漿中甘草次酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.5 Pharmacokinetic parameters of glycyrrhetic acid after i.g.administration of Guizhi Decoction，Guizhi Decoction plus Cinnamomi Ramulus and Guizhi Decoction plus Paeoniae Radix in rats（±s，n=6）

注：*實(shí)測(cè)值；#劑量校正值；

參數(shù) 單位 桂枝湯 桂枝加桂湯 桂枝加芍藥湯*AUC（0－t） μg h/mL 11±6 20±16 12±4#AUC（0－t）/dose （μg h/mL）/（mg/kg） 0.40±0.20 0.73±0.58 0.41±0.14 T1/2 h 6.6±2.5 5.0±1.6 3.9±1.5 Tmax h 11.3±6.8 9.3±3.3 8.0±2.2 Cl/F L/kg/h 3.2±2.0 2.2±1.5 2.8±1.2 Vd/F L/kg 30±21 17±16 14±3*Cmax ng/mL 916±637 1 553±1 156 1 330±387#Cmax/dose （ng/mL）/（mg/kg）32±22 56±41 44±13

2.3 桂枝湯類(lèi)方和相應(yīng)的單味藥及其組合對(duì)芍藥苷腸菌代謝的影響 芍藥苷、芍藥、桂枝湯類(lèi)方和相應(yīng)的單味藥及其組合腸菌孵育體系中芍藥苷0～24 h相對(duì)AUC的值見(jiàn)圖3。與芍藥苷單體組和芍藥組比，類(lèi)方中芍藥苷的腸菌代謝均受到抑制（P＜0.01）；對(duì)于桂枝加芍藥湯而言，體系中芍藥苷的相對(duì)AUC（0－24）大于桂枝加桂湯組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。與空白組相比，甘草、桂枝+甘草均能抑制芍藥苷的腸菌代謝 （P＜0.01），桂枝對(duì)芍藥苷腸菌代謝的抑制不明顯。

圖2 大鼠灌胃給予芍藥苷后血漿中芍藥苷血藥濃度－時(shí)間曲線（±s，n=6）Fig.2 Plasma concentration-time curves of paeoniflorin after intragastric administration in rats（±s，n=6）

表6 大鼠灌胃給予芍藥苷后血漿中芍藥苷藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters of paeoniflorin after intragastric administration in rats（±s，n=6）

表6 大鼠灌胃給予芍藥苷后血漿中芍藥苷藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters of paeoniflorin after intragastric administration in rats（±s，n=6）

參數(shù) 單位 劑量/（mg·kg－1）10 20 40 AUC（0－t） μg h/mL 0.40±0.05 0.78±0.09 1.49±0.08 AUC（0－∞） μg h/mL 0.43±0.06 0.82±0.11 1.51±0.09 MRT（0－t） h 1.9±0.6 1.6±0.3 1.5±0.3 T1/2 h 1.5±0.6 1.3±0.7 1.6±0.6 Tmax h 0.50±0.00 0.50±0.00 0.42±0.13 Cl/F L/kg/h 24±4 25±4 27±2 2 Vd/F L/kg 50±19 43±20 61±23 Cmax μg/mL 0.35±0.05 0.65±0.10 1.58±0.16

圖3 芍藥苷、芍藥、桂枝湯類(lèi)方及不同配伍藥物腸菌孵育后芍藥苷的0～24 h相對(duì)曲線下面積圖（±s，n=3）Fig.3 Relative AUC（0－24）of paeoniflorin after incubation（±s，n=3）

4 討論

桂枝湯類(lèi)方作為臨床廣泛應(yīng)用的一類(lèi)中藥復(fù)方，目前對(duì)其的報(bào)道多為藥效學(xué)和臨床應(yīng)用研究，未有對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究報(bào)道，對(duì)其有效成分的體內(nèi)過(guò)程和動(dòng)力學(xué)規(guī)律缺乏研究。桂皮醛和桂皮酸是桂枝的主要成分，桂皮醛是桂枝揮發(fā)油的主要成分，進(jìn)入體內(nèi)后迅速被氧化為桂皮酸，再進(jìn)一步發(fā)生β－氧化，生成苯甲酸，在尿中以馬尿酸的形式排泄［12，13］。前期研究表明，桂皮醛單體給藥后在胃腸道已開(kāi)始轉(zhuǎn)化為桂皮酸，肝臟和血漿中未檢測(cè)到桂皮醛，證明其在吸收入血之前已經(jīng)在肝臟中轉(zhuǎn)化為桂皮酸［5］。桂枝湯類(lèi)方的藥效成分對(duì)體溫、血壓等的調(diào)節(jié)作用均需進(jìn)入中樞后起作用，故研究桂枝中主要入血成分桂皮酸及其代謝產(chǎn)物馬尿酸的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程十分必要。經(jīng)過(guò)大鼠灌胃給予桂枝湯類(lèi)方后體內(nèi)成分的篩選，確定芍藥苷和甘草次酸分別為臣藥芍藥和佐藥甘草的檢測(cè)成分。本研究用LC-MS/MS測(cè)定大鼠灌胃給予桂枝湯類(lèi)方后體內(nèi)主要成分桂皮酸、馬尿酸、芍藥苷和甘草次酸血藥濃度的經(jīng)時(shí)變化，并比較3個(gè)復(fù)方中各成分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異，闡明桂枝類(lèi)方的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律和配伍影響。

本研究結(jié)果表明與桂枝湯和桂枝加芍藥湯組比，桂枝加桂湯組桂皮酸的Cmax和AUC升高，證明其體內(nèi)暴露增加。桂皮酸為桂枝的主要入血成分，桂枝加桂湯中桂枝藥量增加，旨在加強(qiáng)助陽(yáng)平?jīng)_之力，用于治療心陽(yáng)虛弱，寒水凌心之奔豚［3］。推測(cè)桂枝加桂湯組桂皮酸體內(nèi)暴露的增加將有助于該復(fù)方中桂枝藥效作用的發(fā)揮。

桂枝湯類(lèi)方提取物細(xì)粉中桂皮酸、芍藥苷和甘草酸的量有很大的不同［10］，這種含有量上的差異是來(lái)源于藥味用量及制備過(guò)程 （煎煮）。在本研究中，桂枝湯中桂枝和芍藥均為7.4 g/kg，甘草為4.9 g/kg，而桂枝加桂湯中的桂枝根據(jù)原方加量到12.3 g/kg，桂枝加芍藥湯中的芍藥根據(jù)原方加量到14.8 g/kg。由于各給藥組提取物中各成分的量以及各復(fù)方藥味劑量的差異，導(dǎo)致各組中桂皮酸、芍藥苷和甘草酸的給藥劑量不一致。為了消除這種給藥劑量上的不同所帶來(lái)的影響，本研究中將所有劑量相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) （AUC及Cmax）均進(jìn)行了劑量校正 （AUC/dose及Cmax/dose）。通過(guò)對(duì)各組中AUC/dose及Cmax/dose的比較本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)劑量校正后，對(duì)于桂皮酸而言，各組Cmax和AUC的差異無(wú)顯著性意義，證明配伍對(duì)桂皮酸體內(nèi)過(guò)程的影響是體外的藥味用量差異造成的，并非由復(fù)方中配伍藥物的藥動(dòng)學(xué)相互作用引起。對(duì)于芍藥苷而言，各組劑量校正后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示配伍對(duì)芍藥苷的體內(nèi)過(guò)程有影響。由于桂枝加芍藥湯中芍藥苷的量高于其他兩方，為分析是否因非線性藥動(dòng)學(xué)的問(wèn)題，本研究進(jìn)行了10、20和40 mg/kg的3個(gè)劑量的芍藥苷的藥動(dòng)學(xué)研究，結(jié)果表明為線性動(dòng)力學(xué)，因此桂枝加芍藥湯組芍藥苷的在大鼠體內(nèi)的Cmax的顯著升高是由配伍引起的?，F(xiàn)代藥理研究表明，芍藥苷具有鎮(zhèn)痛、抗驚厥和解痙等作用，桂枝加芍藥湯臨床用于治療黏連性腸梗阻、腸易激綜合征等胃腸道疾病，推測(cè)與芍藥苷舒張胃腸道平滑肌的作用有關(guān)。而與桂枝加桂湯比，芍藥苷體內(nèi)峰濃度的提高可能有利于其藥效作用的發(fā)揮。

中藥傳統(tǒng)多為口服給藥，藥物進(jìn)入機(jī)體后，常要發(fā)生氧化、還原、水解等多種化學(xué)反應(yīng)，其中一個(gè)重要的代謝場(chǎng)所就在腸道，在腸菌的作用下，藥物被代謝轉(zhuǎn)化。因此，研究腸內(nèi)菌群對(duì)中藥苷類(lèi)成分體內(nèi)過(guò)程的影響具有十分重要的意義。芍藥苷是芍藥的主要有效成分之一，是一種單萜類(lèi)糖苷化合物，可被腸菌代謝。為了闡明桂枝湯類(lèi)方中芍藥苷藥動(dòng)學(xué)差異的機(jī)制，本研究對(duì)桂枝湯類(lèi)方中芍藥苷的腸菌代謝進(jìn)行了比較。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)桂枝湯類(lèi)方中的藥物配伍可抑制芍藥苷的腸菌代謝，其中桂枝加芍藥湯對(duì)芍藥苷腸菌代謝的抑制作用大于桂枝加桂湯。桂枝加芍藥湯中芍藥苷在腸中的代謝減慢，導(dǎo)致腸道中芍藥苷原形增多，芍藥苷吸收入血增多，Cmax增高。進(jìn)一步對(duì)桂枝、甘草和桂枝+甘草與芍藥配伍后的腸菌代謝能力進(jìn)行比較，結(jié)果配伍甘草對(duì)芍藥苷的腸菌代謝抑制作用最強(qiáng)。

桂枝湯類(lèi)方中甘草的功用有兩方面：一為佐藥，益氣和中，合桂枝以解肌，合芍藥以益陰；一為使藥，調(diào)和諸藥。甘草酸是甘草的主要成分，口服后可在消化管內(nèi)被腸道細(xì)菌分解成為甘草次酸而被吸收，也可被腸道吸收在肝臟中被轉(zhuǎn)化為甘草次酸［8］。本研究中各組甘草次酸于灌胃給藥后15 min可檢測(cè)到，吸收較快，但達(dá)峰時(shí)間較慢，為6～12 h，推測(cè)可能是由于甘草酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成甘草次酸的過(guò)程推遲了甘草次酸的達(dá)峰；甘草次酸的消除較慢，給藥后48 h仍能檢測(cè)到，有利于藥效作用的持續(xù)發(fā)揮。

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Pharmacokinetics of Guizhi Decoctions in rats

CHEN Ying-rong1， GAO Cheng-lu2， QIU Fu-rong2， MA Yue-ming1*
（1.Laboratory of Pharmacokinetics，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.Laboratory of Clinical Pharmacokinetics，Shanghai Shuguang Hospital，Shanghai 201203，China）

AIMTo compare the differences of pharmacokinetics among Guizhi Decoctions.METHODS

LC-MS/MS was employed to analyze the plasma concentrations of cinnamic acid，hippuric acid，peoniflorin and glycyrrhetic acid in rats fed with Guizhi Decoction（Cinnamomi Ramulus，Paeoniae alba Radix，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，Zingiberis recens Rhizoma，Jujubae Fructus），Guizhi Decoction plusCinnamomi Ramulusand Guizhi Decoction plusPaeoniae Radix，respectively.The differences of pharmacokinetic parameters and the effect of peoniflorin on the intestinal flora metabolism were tested.RESULTSAfter dose correction，the pharmacokinetic parameters of cinnamic acid，hippuric acid and glycyrrhetinic acid showed no significant difference on Guizhi Decoctions，but paeoniflorin content in Guizhi Decoctionplus Paeoniae Radixincreased and showed a statistical difference with a dose-dependent relationship.The inhibitory effect of addingGlycyrrhizae Radix et Rhizomaon paeonifiorin metabolism presents the most in relation to the inhibition of intestinal flora metabolism.CONCLUSIONPharmacokinetics of peoniflorin were different among Guizhi Decoctions in rats.The inhibition of compatibility on the metabolism of paeoniflorin by intestinal flora contributed to the pharmacokinetic difference of paeoniflorin.

Guizhi Decoctions；LC-MS/MS；pharmacokinetics；compatibility；paeoniflorin；intestinal flora metabolism

R969.1

A

1001-1528（2013）04-0683-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.011

2012-10-14

上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目 （2009）、上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 （J50303）；重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目 （2012ZX09303009-001）

陳瑩蓉 （1984—），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：中藥藥理學(xué)。Tel：（021）51322389，E-mail：chenyingrong2006@163.com

*通信作者：馬越鳴，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥代動(dòng)力學(xué)。Tel：（021）51322200，E-mail：mayueming_117@126.com