三七總皂苷對大鼠脊髓半橫斷損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用①

皮斌，孫揚(yáng)，熊巍，沈田，周志揚(yáng)

三七總皂苷對大鼠脊髓半橫斷損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用①

皮斌1，孫揚(yáng)2，熊巍2，沈田2，周志揚(yáng)2

目的探討三七總皂苷(PNS)對大鼠脊髓半橫斷損傷后繼發(fā)性損害的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法55只成年Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(n=5)、脊髓損傷組(n=25)和PNS組(n=25)。造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d和21 d應(yīng)用BBB評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行行為學(xué)評分，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材后對大鼠脊髓組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化分析。結(jié)果PNS干預(yù)后3 d、7 d、14 d和21 d時(shí)PNS組大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)優(yōu)于脊髓損傷組(P＜0.05)。7 d、14 d和21 d時(shí)PNS組尼氏染色示神經(jīng)元壞死減少，形態(tài)完整，且胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)陽性細(xì)胞數(shù)減少，神經(jīng)元形態(tài)完整，cPLA2表達(dá)增強(qiáng)被抑制。結(jié)論P(yáng)NS可通過抑制cPLA2表達(dá)在脊髓損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

三七總皂苷；脊髓損傷；胞漿型磷脂酶A2；大鼠

[本文著錄格式]皮斌，孫揚(yáng)，熊巍，等.三七總皂苷對大鼠脊髓半橫斷損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2013,19(10):922-926.

脊髓損傷包括原發(fā)性損傷與繼發(fā)性損傷。研究表明，缺血、缺氧、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、鈣超載、興奮性毒性等多種病理因素介導(dǎo)的損害作用參與繼發(fā)性脊髓損傷，顯著地?cái)U(kuò)大損傷的范圍與程度[1]。目前脊髓損傷的研究熱點(diǎn)在于對繼發(fā)性脊髓損傷的有效干預(yù)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)與再生。因此，針對繼發(fā)性損傷有害因素的干預(yù)是提高患者生活質(zhì)量，改善預(yù)后的關(guān)鍵。

近期的研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后胞漿型磷脂酶A2 (cytosolic phospholipase A2,cPLA2)表達(dá)與活性普遍升高，通過對花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的酶解作用產(chǎn)生大量脂質(zhì)產(chǎn)物，促進(jìn)炎癥發(fā)生與活性氧生成，從而導(dǎo)致大量神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞壞死、凋亡[2-3]。針對cPLA2的抑制劑均可有效促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，說明cPLA2為脊髓損傷病理過程中的重要分子[4]。

三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)主要由人參皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1、R2等40多種皂苷組成，臨床常用來治療心腦血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面的疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，PNS能有效抑制血小板聚集與抗脂質(zhì)過氧化，改善微循環(huán)，擴(kuò)張痙攣血管，增加血流量，阻斷鈣離子內(nèi)流，可能在脊髓損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[6-7]。本研究利用脊髓半橫斷模型大鼠探討PNS對脊髓損傷的保護(hù)作用，并觀察治療效果，初步探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

55只健康成年Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，體重200～250 g，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(n=5)、脊髓損傷組(n=25)和PNS組(n=25)。PNS組在脊髓損傷造模成功后15 min經(jīng)腹腔給予PNS 20 mg/kg，以后每天給藥1次，而假手術(shù)組和脊髓損傷組在相同時(shí)點(diǎn)經(jīng)腹腔注射等量0.9% NaCl溶液。

1.2試劑與儀器

小牛血清凍干粉(SIGMA)，TrintonX-100(SIGMA)，兔抗鼠cPLA2(Santa Cruz)，生物素化羊抗兔IgG(Vector)，ABC試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，PNS(廣西梧州制藥)，雙人雙目手術(shù)顯微鏡(GX.SS.2223，上海)，顯微鏡(Olympus, Japan)，冰凍切片機(jī)(ShanDon,England)，圖像分析系統(tǒng)(Motic ImagesAdvanced 3.2)。

1.3動(dòng)物模型制作

脊髓損傷組和PNS組大鼠稱重，10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，俯臥位固定，手術(shù)區(qū)剪毛，絡(luò)合碘消毒，以T10棘突為中心做背部正中切口，長3～4 cm，顯露T9～T11棘突及椎板，咬除T9椎板直至顯露脊髓后動(dòng)脈。以脊髓后動(dòng)脈為中點(diǎn)，扎銀針定位，刀片沿銀針往下插入，直至觸及骨質(zhì)，然后向外側(cè)橫斷該側(cè)脊髓。術(shù)后在切口處用0.9%NaCl溶液沖洗，并加入少量青霉素鈉粉末防止感染，逐層縫合肌肉、筋膜及皮膚后單籠飼養(yǎng)，定時(shí)喂食，給水，保持墊料干燥。

造模成功標(biāo)志：動(dòng)物麻醉蘇醒后，損傷側(cè)后肢自主運(yùn)動(dòng)消失，但有感覺，對側(cè)喪失感覺但活動(dòng)自如。

假手術(shù)組大鼠單純切除椎板，不橫斷脊髓。

造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d處死大鼠進(jìn)行取材。4%多聚甲醛溶液經(jīng)主動(dòng)脈插管灌注固定后取距損傷區(qū)0.5 cm上下兩段脊髓組織。標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定4 h后經(jīng)梯度蔗糖溶液脫水，標(biāo)本放入-70℃冰箱保存。

1.4行為學(xué)觀察及評分

評定者不參與動(dòng)物模型制作，對所觀察動(dòng)物接受的處理不知情。參照改良BBB后肢運(yùn)動(dòng)功能評分表[8]，評分時(shí)將動(dòng)物置于平坦開闊處觀察后肢關(guān)節(jié)活動(dòng)度和范圍、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)程度、承重情況等，觀察時(shí)間約為5 min。運(yùn)動(dòng)功能共分為22個(gè)等級，0分為全癱，21分為完全能自如運(yùn)動(dòng)。假手術(shù)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)評定同一只大鼠。

1.5病理形態(tài)學(xué)檢查

標(biāo)本取出后經(jīng)PBS緩沖液包埋，在恒冷切片內(nèi)行連續(xù)切片，片厚15 μm，尼氏染液染色，光鏡下觀察前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及其周圍神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 cPLA2免疫組織化學(xué)檢測

切片脫蠟水化后，用3%H2O2室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清室溫封閉20 min后加入1∶100稀釋兔抗大鼠cPLA2抗體，4℃過夜。PBS沖洗后滴加生物素化羊抗兔IgG，室溫下20 min。0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次3 min。DAB溶液室溫下顯色5 min，PBS沖洗終止顯色。最后用蘇木素復(fù)染，二甲苯透明后中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照，排除二抗的非特異性染色。陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色染色。

1.7圖像處理

利用Image J軟件對免疫組化切片圖像進(jìn)行分析。每組取3張切片，導(dǎo)入圖像系統(tǒng)后每切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊的高倍鏡視野，測定免疫組化陽性染色面積。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，與對照組比較應(yīng)用成組t檢驗(yàn)，各組間比較應(yīng)用方差分析。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察及評分

術(shù)前所有動(dòng)物BBB評分均為21分。造模成功后當(dāng)天，脊髓損傷組動(dòng)物均出現(xiàn)左后肢全癱，術(shù)后前3 d BBB評分較低，與脊髓休克期一致。損傷后7 d起，脊髓損傷組與PNS組運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)。3 d、7 d、14 d和21 d時(shí)PNS組BBB評分高于脊髓損傷組(P＜0.05)。見表1。

表1 脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能BBB評分

2.2病理形態(tài)學(xué)檢查

7 d、14 d和21 d的病理切片光鏡下顯示：①假手術(shù)組，大鼠脊髓組織神經(jīng)元形態(tài)完整，胞漿內(nèi)尼氏小體清晰可見。②脊髓損傷組，脊髓組織正常結(jié)構(gòu)喪失，灰質(zhì)形成較大空腔，少見完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可見明顯神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生反應(yīng)。多數(shù)神經(jīng)元胞核溶解，胞漿混濁，見不到尼氏小體。白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)數(shù)量不等的微囊。③PNS組：脊髓組織結(jié)構(gòu)比較清晰，損傷側(cè)的灰質(zhì)內(nèi)偶見小空腔，有較多的正常神經(jīng)元，僅有輕度的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生反應(yīng)。神經(jīng)元細(xì)胞核稍濃聚，核膜完整，胞漿內(nèi)尼氏小體清晰可見，軸突清晰完整，白質(zhì)區(qū)微囊變較脊髓損傷組明顯減少。見圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)改變(尼氏染色，400×)

2.3 PNS干預(yù)后cPLA2表達(dá)變化

cPLA2免疫組化顯示，脊髓損傷后3 d起脊髓損傷組cPLA2表達(dá)增加，免疫陽性細(xì)胞數(shù)增多，神經(jīng)元胞體腫脹。而PNS組cPLA2陽性細(xì)胞數(shù)較少，且cPLA2免疫陽性面積較少，神經(jīng)元形態(tài)更為完整，周圍神經(jīng)組織破壞程度較輕。在7 d、14 d和21 d時(shí)脊髓損傷組cPLA2表達(dá)均強(qiáng)于PNS組。見表2和圖2。

表2 脊髓損傷后各組不同時(shí)間點(diǎn)cPLA2免疫陽性面積值

注：PNS組與假手術(shù)組比較，a:t=2.10,P=0.03;b:t=4.51,P=0.001;c:t=6.25,P=0.001;d:t=7.14,P=0.001;e:t=6.45,P=0.001。PNS組與脊髓損傷組比較，f:t=1.31,P=0.23;g:t=1.68,P=0.13;h:t=3.07,P=0.015;j:t=2.45,P=0.04;k:t=2.48,P=0.04

圖2 PNS組與脊髓損傷組脊髓損傷節(jié)段cPLA2表達(dá)(免疫組化，400×)

3討論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)損傷基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一系列病理改變是導(dǎo)致脊髓組織發(fā)生不可逆的進(jìn)行性變性、壞死的主要原因，而這種繼發(fā)性損傷是神經(jīng)元丟失的主要環(huán)節(jié)[9-10]。目前認(rèn)為，多種因素參與脊髓損傷繼發(fā)性損害，如炎癥反應(yīng)、自由基、興奮性毒性、Ca2+超載等。因此，在損傷急性期如何減輕或消除繼發(fā)性病理反應(yīng)，保護(hù)殘存的軸突和神經(jīng)元不再遭受繼發(fā)性損傷，是目前脊髓損傷治療研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

cPLA2在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及缺血缺氧性疾病中的損傷作用已被廣為證實(shí)，而cPLA2抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用也在大量文獻(xiàn)中報(bào)道。近期研究證實(shí)，cPLA2廣泛參與包括阿爾茨海默病、脊髓損傷、多發(fā)性硬化在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程，且cPLA2的表達(dá)增高均與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)[11]。同時(shí)，cPLA2敲除大鼠在腦缺血損傷中缺血梗死面積、腦細(xì)胞水腫均得到緩解，神經(jīng)系統(tǒng)評分更為良好，說明cPLA2為參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要分子。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，脊髓損傷后cPLA2表達(dá)與活性顯著增強(qiáng)，分解膜磷脂釋放大量AA，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致神經(jīng)損傷[12]。應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)方法發(fā)現(xiàn)，cPLA2主要定位于神經(jīng)元與少突膠質(zhì)細(xì)胞，損傷軸突及星型膠質(zhì)細(xì)胞也可見cPLA2表達(dá)增強(qiáng)。cPLA2是水解膜磷脂的關(guān)鍵酶，可特異性水解神經(jīng)細(xì)胞膜磷脂，釋放大量AA，而AA經(jīng)環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)、脂肪氧化酶(lipoxygenase,LOX)代謝后產(chǎn)生的脂類炎性介質(zhì)如血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等廣泛參與炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激，并可改變局部損傷區(qū)血流動(dòng)力學(xué)，進(jìn)而加重?fù)p害，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死、凋亡。同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，cPLA2激活劑蜂毒素干預(yù)后能明顯促進(jìn)神經(jīng)元凋亡、脫髓鞘化與氧化損傷[13]。而上述效應(yīng)均能被cPLA2抑制劑米帕林逆轉(zhuǎn)，說明cPLA2為參與脊髓繼發(fā)性損傷的重要分子。

三七為五加科多年生草本植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的根，主要活性成分是PNS。中醫(yī)學(xué)理論指出，三七具有化瘀止血、活血定痛之效，廣泛應(yīng)用于腦卒中等疾病的治療。人參皂苷單體Rb1在短暫性腦缺血模型中，可顯著減少梗死面積，并減少再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化[14]。實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注動(dòng)物模型中，PNS(25 mg/kg)能有效降低TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，并能抑制caspase-1與caspase-3的表達(dá)，為一種極具潛力的神經(jīng)保護(hù)劑[6]。本研究中，經(jīng)PNS干預(yù)后脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)優(yōu)于脊髓損傷組，PNS組在3 d、7 d、14 d和21 d評分高于脊髓損傷組，說明PNS有助于大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。選取損傷區(qū)脊髓組織行尼氏染色后發(fā)現(xiàn)，PNS可保持神經(jīng)元完整性，神經(jīng)元壞死和破壞減少，周圍神經(jīng)組織更為完整，說明PNS可在形態(tài)學(xué)上發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

研究表明，PNS可抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶活性與中性粒細(xì)胞浸潤，調(diào)節(jié)AA代謝，改變AA家族中對血小板聚集和血管舒縮有作用的前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)與血栓素 A2(thromboxane A2, TXA2)之間的相互關(guān)系，糾正PGI2-TXA2之間的比例失衡，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[15-16]。

那么PNS在脊髓損傷中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制是否與AA代謝的關(guān)鍵酶cPLA2相關(guān)呢？本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后PNS對cPLA2的表達(dá)有明顯的抑制作用，在7 d、14 d和21 d時(shí)PNS組cPLA2免疫陽性面積均低于脊髓損傷組，且經(jīng)PNS干預(yù)的神經(jīng)元形態(tài)完整，腫脹壞死少于脊髓損傷組，提示PNS可通過抑制cPLA2表達(dá)在脊髓損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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Protective Effect of Panax Notoginseng Saponins in Spinal Cord Hemisection Injured Rats

PI Bin,SUN Yang,XIONG Wei,et al.Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215021,Jiangsu,China

ObjectiveTo investigate the protective effect and cytosolic phospholipase A2(cPLA2)associated mechanism of panax notoginseng saponins(PNS)in spinal cord hemisection injured rats.Methods55 adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:sham group(n=5),spinal cord injury group(n=25)and PNS group(n=25).The rats were evaluated with BBB score,pathology and immunohistochemistry 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d after intervention.ResultsCompared to the spinal cord injury group,motor recovery was significantly better in PNS group 3 d,7 d,14 d and 21 d after intervention(P＜0.05).Nissl staining showed less neuron necrosis and more integrated neural cells in morphology in PNS group 7 d,14 d and 21 d after intervention.Cytosolic phospholipase A2(cPLA2)expression was inhabited,and less number of positive cells were found in PNS group 7 d,14 d and 21 d after intervention.ConclusionPNS can inhibit the expression of cPLA2 after spinal cord injury,which may be one of the mechanisms of its effect on promoting motor recovery.

panax notoginseng saponins;spinal cord injury;cytosolic phospholipaseA2;rats

R651.2

A

1006-9771(2013)10-0922-05

2013-04-09

2013-09-11)

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，江蘇蘇州市215021；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南長沙市410001。作者簡介：皮斌(1985-)，男，漢族，湖南常德市人，博士，醫(yī)師，主要研究方向：脊柱外科基礎(chǔ)及臨床。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.10.006