百草枯對小鼠神經(jīng)行為發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶功能的影響

王翹楚，婁丹，田雨來，常秀麗，周志俊

(復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/教育部公共衛(wèi)生安全重點實驗室/WHO職業(yè)衛(wèi)生合作中心，上海 200032)

百草枯(Paraquat)(分子式 C12H14Cl2N2)，是一種速效觸殺型、滅生性除草劑，易溶于水，微溶于酒精，目前在世界130多個國家和地區(qū)廣泛使用。百草枯進入人體后，在肺組織中濃度較高，在腎小管中不被重吸收，以原型從腎臟排出［1］。百草枯為中等毒性，能使急性中毒患者發(fā)生肺纖維化，死亡率較高。近年來，百草枯的大量使用引發(fā)了人們對其長期低劑量接觸的慢性毒性作用和對生態(tài)環(huán)境影響的擔(dān)憂。近年的研究已經(jīng)開始關(guān)注PQ對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。諸多流行病學(xué)研究表明百草枯的長期暴露同神經(jīng)系統(tǒng)病變尤其是帕金森病(PD)有關(guān)［2］。職業(yè)接觸評估已經(jīng)證實了PQ暴露與PD發(fā)病的關(guān)系［4］，細胞實驗也證實百草枯能夠影響細胞的多巴胺系統(tǒng)的動態(tài)平衡，導(dǎo)致細胞信號傳導(dǎo)通路異常［3］。實驗室研究也發(fā)現(xiàn)小鼠亞慢性暴露 PQ后出現(xiàn)帕金森樣癥狀，使用PQ對成年C57BL/6J小鼠進行染毒后黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量會出現(xiàn)選擇性地減少［5］。另外，在神經(jīng)發(fā)育早期，由于血腦屏障發(fā)育不完善及一些功能蛋白活性很低或缺乏，發(fā)育早期易受到環(huán)境神經(jīng)毒物毒作用的影響，導(dǎo)致神經(jīng)生理功能的異常，并對成年后的中樞神經(jīng)生理功能和防御機制造成影響。有研究發(fā)現(xiàn)出生早期暴露毒死蜱會引起子代大鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶功能下降［6］，新生期的C57BL/6J小鼠暴露于大劑量的百草枯，成年后小鼠出現(xiàn)類似于帕金森病的行為表現(xiàn)［7］。本研究欲通過對新生小鼠染毒百草枯，探討神經(jīng)發(fā)育早期百草枯的神經(jīng)毒作用，觀察成年后小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，從而進一步補充和完善百草枯的神經(jīng)毒作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理

3周齡雄性 C57BL/6J小鼠，體重(9±2)g，80只，來源于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物部【SCXK(滬)2009－019】，實驗在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物部【SYXK(滬)2009－0082】進行，隨機分為 5組(每組 16 只)，每日分別灌胃百草枯 0、1.25、2.5、5、10 mg/(kg·d)，對照組按照0.1 mL/10 g給予相同體積的生理鹽水。動物房室溫保持在18～22℃的范圍內(nèi)，日溫差不超過3℃，保證飲水供給充足，每周至少更換兩次墊料，連續(xù)灌胃30 d，對每組受試動物進行實驗處置。

1.2 主要試劑和儀器

百草枯(分析純，美國 Sigma公司)，生理鹽水，天平，小鼠籠具，飲水瓶(瓶塞上裝有金屬飲水管的塑料瓶)，墊料(闊葉林木的刨花和鋸末);Morris水迷宮程序選用WaterMaze 3軟件，來自Coulbourn公司，Morris水迷宮及避暗實驗設(shè)備由復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院提供。

1.3 方法

1.3.1 避暗實驗

1.3.2 Morris水迷宮

包括定位航行及空間探索，其中定位航行試驗旨在檢測其空間學(xué)習(xí)能力，空間探索試驗旨在檢測其空間記憶能力［9］。此次實驗采用的水迷宮為一直徑120 cm的圓形水池，水池凈高50 cm，水深30 cm，等分為 I、II、III及 IV 象限，在 II象限中間距邊緣30 cm放一低于水面1 cm黑色平臺，平臺直徑為10 cm。水迷宮外參照物不變，進行訓(xùn)練時水溫恒定(25±1)℃。

(1)定位航行實驗:實驗前小鼠自由游泳1 min。每天訓(xùn)練4次，每次小鼠于池邊4個固定點面向池壁入水，每次小鼠實驗的先后順序一定，將實驗小鼠面向池壁放入水中同時開始錄像。記錄實驗小鼠在60s內(nèi)從不同象限入水至發(fā)現(xiàn)并爬上平臺的時間(以秒記)作為訓(xùn)練潛伏期，即逃避潛伏期，找到后在平臺上保持15 s，如找不到，則引導(dǎo)到平臺上保持15 s，記錄小鼠的登臺潛伏期，每4次的均值作為1次平均訓(xùn)練潛伏期，連續(xù)訓(xùn)練6d，以此測定空間學(xué)習(xí)能力。如果動物在60s內(nèi)未找到平臺，時間記錄為60 s。

(2)空間探索實驗:此實驗用于測量動物對平臺空間位置準確記憶，即記憶保持能力。第6天定位航行結(jié)束后立即進行空間探索實驗，撤去平臺，將小鼠分別從同一象限固定位置面向池壁放入水中，記錄60s內(nèi)小鼠從入水至找到平臺的時間、原平臺象限游泳時間和原平臺象限游泳距離占總距離的百分比，測試小鼠的空間記憶能力。

1.3.3 腦臟器系數(shù)

神經(jīng)行為學(xué)測試結(jié)束后，頸椎脫臼法將小鼠處死，取出大腦稱得濕重，計算腦的臟器系數(shù)(臟器重量/體重 ×100)。

1.3.4 病理學(xué)檢查

3.發(fā)生的危險因素：首次進行HAART、基線病毒載量高及基線CD4+T淋巴細胞數(shù)較低者為IRIS發(fā)生的危險因素[9]。此類患者在抗病毒治療后應(yīng)警惕IRIS的發(fā)生。有效控制急性期機會性感染后再進行HAART或HAART前積極發(fā)現(xiàn)潛在的機會性感染可降低IRIS的發(fā)生率。

所取臟器標(biāo)本用4%中性甲醛液固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片和 HE染色，同時中腦的組織切片又進行了甲苯胺藍染色，封片鏡檢。

1.3.5 透射電鏡檢查

從每組動物中取4只小鼠，頸椎脫臼后，取腦，快速用鋒利剪刀剪下一小塊組織，立即浸潤在固定液內(nèi)修整，取黑質(zhì)部組織切成1 mm ×1 mm ×0.5 mm的小塊，1%四氧化鋨固定，再經(jīng)緩沖液沖洗，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片，鉛鈾染色，透射電鏡Hitachi－7500觀察中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 一般狀況觀察

染毒期間每天對小鼠進行稱重，記錄體重，并進行一般狀況觀察。各組小鼠在染毒期間一般情況均良好，毛色光潔度、活力、步態(tài)、分泌物、眼外觀、呼吸、神態(tài)等表現(xiàn)無異常。染毒結(jié)束后，統(tǒng)計30 d小鼠的體重數(shù)據(jù)，繪制體重變化曲線(圖1，彩插1)，各組小鼠體重均有上升趨勢，對體重數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組小鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組小鼠染毒期間體重變化Fig.1 Analysis of the body weight changes of the mice during the experiment

2.2 腦臟器系數(shù)

各組小鼠大腦臟器系數(shù)的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但是按給藥劑量由低到高，各組小鼠腦的臟器系數(shù)有下降的趨勢(圖2)。

圖2 各染毒組小鼠大腦臟器系數(shù)比較Fig.2 Comparison of the brain organ coefficients of the mice

2.3 避暗實驗

隨著染毒濃度的增加，各組小鼠的避暗潛伏期逐漸延長，與對照組相比，高劑量組小鼠潛伏期的延長具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

表1 各組小鼠避暗實驗測試結(jié)果(，n=8)Tab.1 Results of the passive avoidance task test()

表1 各組小鼠避暗實驗測試結(jié)果(，n=8)Tab.1 Results of the passive avoidance task test()

注:*:與對照組相比，高劑量組小鼠的避暗潛伏期的延長具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Note:*:The results of passive avoidance task test in the high dose group was significantly longer than that of the control group(P＜0.05).

潛伏期(s)Latency period對照組 control 31.99±16.3873極低劑量組 Lowest dose 56.53±41.8188低劑量組 Low dose 81.56±32.3418中劑量組 Moderate dose 82.91±40.8197高劑量組 High dose 168.54±86.5096組別Groups*

2.4 Morris水迷宮

無論是小鼠在原平臺象限游泳的時間占總時間的百分比，還是小鼠穿越平臺位置的次數(shù)，以及小鼠在空間探索實驗中的潛伏期，各劑量組間的差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，但隨著給藥劑量的增高60 s內(nèi)各組小鼠在原平臺象限游泳的時間有逐漸增加的趨勢(圖3)。

圖3 Morris水迷宮各染毒組小鼠在原平臺象限游泳時間比較Fig.3 Comparison of the swimming time of the mice in the platform quadrant of the Morris water maze

2.5 病理學(xué)檢查

對照組中腦黑質(zhì)HE染色和甲苯胺藍染色均可見大量深染的黑質(zhì)細胞(圖4，彩插1)，與對照組相比，高劑量組深染黑質(zhì)細胞明顯減少(圖5，彩插1)。

圖4 對照組小鼠中腦黑質(zhì)HE染色Fig.4 Histology of the substantia nigra in a control mouse. HE staining

圖5 高劑量組小鼠中腦黑質(zhì)HE染色Fig.5 Histology of the substantia nigra in a mouse of the high-dose group . HE staining

2.6 中腦電鏡超微結(jié)構(gòu)

利用透射電鏡觀察各組小鼠中腦黑質(zhì)部超微結(jié)構(gòu)，其中在所取的4例高劑量樣本中觀察到一例凋亡的神經(jīng)元細胞，細胞核內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)邊集，其他劑量組沒有觀察到凋亡的神經(jīng)元細胞。

3 討論

百草枯作為一種被廣泛使用的除草劑，近年來引起越來越多的關(guān)注，國內(nèi)外的多項研究表明百草枯能夠增加罹患帕金森病的風(fēng)險，造成小鼠帕金森癥樣的表現(xiàn)并能導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路的多巴胺含量的減少［10］。本次研究通過對發(fā)育期小鼠進行百草枯染毒，探究百草枯染毒對小鼠神經(jīng)行為發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

本研究中，染毒期間各組小鼠的體重均有上升，染毒結(jié)束后，各組體重差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明低劑量暴露于百草枯對小鼠不會產(chǎn)生明顯的毒作用。臟器系數(shù)是毒理學(xué)試驗中靈敏、有效的指標(biāo)之一［11］。正常情況下各臟器與體重的比值比較恒定。動物染毒后，受損臟器重量發(fā)生改變，臟器系數(shù)也隨之改變。臟器系數(shù)增大，說明臟器發(fā)生充血、水腫或增生肥大等;臟器系數(shù)減小，說明臟器發(fā)生萎縮及其他退行性變。雖然腦臟器系數(shù)的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但是隨著各染毒組百草枯劑量的升高，腦的臟器系數(shù)有逐漸下降的趨勢，這提示了百草枯對腦發(fā)育的損傷和影響。結(jié)合中腦超微電鏡結(jié)構(gòu)和病理切片的結(jié)果，在高劑量組發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元細胞的損傷和黑質(zhì)細胞減少的現(xiàn)象，說明低劑量百草枯能夠損傷小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

在行為學(xué)測試中，我們采用了Morris水迷宮實驗和避暗實驗，二者都可以用來檢測動物的學(xué)習(xí)記憶能力，并可根據(jù)所得實驗結(jié)果評價動物的高級中樞神經(jīng)功能。其中，Morris水迷宮主要側(cè)重于動物視覺相關(guān)的空間學(xué)習(xí)能力，屬于主動學(xué)習(xí)，對動物的體力要求比較高［12］;而避暗實驗則對記憶再現(xiàn)功能有較高的敏感性，屬于被動學(xué)習(xí)過程。本次研究中，Morris水迷宮實驗無論是小鼠在原平臺象限游泳的時間占總時間的百分比，還是小鼠穿越平臺位置的次數(shù)，以及小鼠在空間探索實驗中的潛伏期，各劑量組間的差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，但是隨著給藥劑量的增高60 s內(nèi)各組小鼠在原平臺象限游泳的時間卻有逐漸增加的趨勢。而在避暗實驗中，隨著給藥劑量的增加，各組小鼠的潛伏期有逐漸增加的趨勢，且與對照組相比，高劑量組潛伏期的延長具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明百草枯能夠影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，本實驗條件下，百草枯對小鼠的體重沒有影響，對腦神經(jīng)元以及黑質(zhì)細胞可以造成器質(zhì)性的損傷。但是，百草枯對小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力影響并不明顯，卻對被動學(xué)習(xí)能力表現(xiàn)出一定的興奮作用。

對于在避暗實驗中，高劑量組小鼠表現(xiàn)出在被動學(xué)習(xí)能力上的優(yōu)勢這一現(xiàn)象，以及在Morris水迷宮實驗中，隨著給藥劑量的增高60 s內(nèi)各組小鼠在原平臺象限游泳的時間有逐漸增加的趨勢的實驗結(jié)果，考慮有以下可能:①與低劑量興奮作用有關(guān)，即低劑量時表現(xiàn)為輕微的興奮反應(yīng)，而在高劑量時表現(xiàn)為抑制，屬于一種動態(tài)平衡破壞后的適度補償［13］。值得注意的是，以往的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量興奮作用多為發(fā)育早期暴露所致，相比成年動物，發(fā)育期動物更容易出現(xiàn)低劑量興奮作用［14］。這種低劑量興奮效應(yīng)在其他的有毒物質(zhì)如硝酸鑭的相關(guān)研究中也有報道，蔣建軍等［15］在硝酸鑭的低劑量興奮作用研究中發(fā)現(xiàn)，在水迷宮實驗中，隨著染毒劑量的升高，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力逐漸增強，當(dāng)劑量升高到一定界值后，隨著劑量的繼續(xù)升高，學(xué)習(xí)記憶能力又逐漸減弱;②由于海馬與動物的學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)，低劑量的百草枯可能興奮了海馬區(qū)的功能，使小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。另外，本次研究中，在微觀病變已經(jīng)發(fā)生的情況下，學(xué)習(xí)記憶能力并沒有受到損傷，說明，微觀病變早于神經(jīng)行為變化出現(xiàn)，尚未達到能夠損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的病變水平。同時，由于神經(jīng)行為的改變反應(yīng)的是動物的綜合能力，包括視覺、嗅覺、運動功能以及學(xué)習(xí)能力等，微觀病變說明百草枯能夠損傷黑質(zhì)細胞和多巴胺神經(jīng)元，但是此次實驗的百草枯染毒劑量，不足以影響小鼠的神經(jīng)行為功能。為進一步證明以上結(jié)論，在接下來的實驗中需繼續(xù)擴大染毒的范圍，增加染毒組數(shù)，升高染毒劑量，觀察是否隨著染毒劑量的進一步升高，小鼠學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)下降的趨勢，并且測定海馬區(qū)與學(xué)習(xí)記憶能力相關(guān)的代謝產(chǎn)物及功能酶水平，判斷海馬區(qū)是否產(chǎn)生興奮效應(yīng)，以進一步完善研究內(nèi)容。

［1］余方宇.百草枯中毒機制及治療研究進展［J］.臨床急診雜志，2006，7(4):208－212.

［2］婁丹，常秀麗，周志俊.百草枯暴露致帕金森病的機制研究進展［J］.毒理學(xué)雜志，2010，24(3):76－79.

［3］Lou D，Li WH，Zhou ZJ，et al.Paraquat affects the homeostasis of dopaminergic system in PC12 cells ［J］.Pesticide Biochem Physiol，2012，103(6):81 －86.

［4］Tomenson，JA，Campbell，C.Mortality from Parkinson＇s disease and other causes among a workforce manufacturing paraquat:a retrospective cohort study［J］.BMJ open，2011 Jan 1;1(2):e000283.

［5］Yin L，Lu L，Prasad K，et al.Genetic－based，differential sus－ceptibility to paraquat neurotoxicity in mice［J］.Neurotoxicol Teratol，2011，33(3):415 －421.

［6］Jett DA，Navoa RV，Beckles RA，et al.Cognitive function and cholinergic neurochemistry in weanling rats exposed to chlorpyrifos［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2001，174(2):89 － 98.

［7］丁正同，任惠民，蔣雨平，等.百草枯對小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)的影響［J］.復(fù)旦學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2001，28(1):28－31.

［8］Cappon GD，Bush B，Newgreen D，et al.Tolterodine does not affect memory assessed by passive－avoidance response test in mice［J］.Eur J Pharmacol，2008，579(1 －3):225 － 228.

［9］R.Morris.Developments of a water－maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.Neurosci Methods，1984，11:47－60.

［10］Rappold PM，Cui M，Chesser AS，et al.Paraquat neurotoxicity is mediated by the dopamine transporter and organic cation transporter－3 ［J］.Proc Nat Acad Sci U S A，2011，108(51):20766－20771.

［11］馬秀蘭，宋淑云，葉建新，等.對成年大鼠臟器系數(shù)的探討［J］.動物學(xué)雜志，1996，31:25－26.

［12］Saab BJ，Luca RM，Yuen WB，et al.Memantine affects cognitive flexibility in the Morris water maze ［J］.J Alzheimer＇s Disease，2011，27(3):477－482.

［13］Tasker RA，Perry MA，Doucette TA，et al.NMDA receptor involvement in the effects of low dose domoic acid in neonatal rats［J］.Amino Acids，2005，28(2):193 －196.

［14］衛(wèi)立，張洪昌，張愛茜，等.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物低劑量－效應(yīng)研究進展［J］.生態(tài)毒理學(xué)報，2007，2(1):25－31.

［15］蔣建軍，尚蘭琴，楊曉華，等.硝酸鑭對小鼠學(xué)習(xí)記憶低劑量興奮效應(yīng)及其機制研究［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34(22):4225－4232.