長(zhǎng)期酒精暴露對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生殖能力的損傷作用研究

李乃鵬 梁瓊麟 羅國(guó)安 孟憲生▲.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 6600；.清華大學(xué)化學(xué)系，北京 00084

我國(guó)是酒的發(fā)源地，擁有悠久的釀酒歷史和豐富的酒文化，尤其在生活和工作節(jié)奏日益加快的當(dāng)今社會(huì)，酒更是成為人們生活中必不可少的一種飲品。然而大量的事實(shí)表明，大量飲酒會(huì)引起酒精急性中毒，甚至危及生命；長(zhǎng)期飲酒可以引起酒精慢性中毒，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的損傷并引發(fā)一系列的疾病，如長(zhǎng)期大量飲酒可能會(huì)對(duì)人類(lèi)生殖系統(tǒng)造成一定的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，酒精對(duì)小鼠精子數(shù)量和質(zhì)量也有比較明顯的毒性作用[1-2]，長(zhǎng)期酒精暴露會(huì)導(dǎo)致后代發(fā)育和運(yùn)動(dòng)異常[3]；酒精可以迅速通過(guò)胎盤(pán)[4]，影響胚胎和母體間的物質(zhì)吸收、利用和轉(zhuǎn)運(yùn)[5]，間接地?fù)p害胚胎進(jìn)而對(duì)后代的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。但長(zhǎng)期大量飲酒，尤其從幼年時(shí)期開(kāi)始酗酒對(duì)人類(lèi)生殖系統(tǒng)造成的影響，目前研究尚不完善。

為正確認(rèn)識(shí)酒精對(duì)人類(lèi)生育的損傷，提高人類(lèi)生育質(zhì)量，對(duì)酒精生殖毒性的系統(tǒng)研究具有深遠(yuǎn)的意義。然而利用人類(lèi)自身進(jìn)行酒精生殖毒性系統(tǒng)研究的可行性不大，而利用鼠、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行研究，存在實(shí)驗(yàn)成本高、周期長(zhǎng)、可選用實(shí)驗(yàn)參數(shù)少、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。

秀麗線蟲(chóng)是一種優(yōu)秀的模式生物。該模式生物具有體積小、身體透明度高、繁殖速度快、生命周期短、遺傳背景清晰等諸多優(yōu)點(diǎn)，更適合在實(shí)驗(yàn)室中大量培養(yǎng)。秀麗線蟲(chóng)對(duì)外界環(huán)境的變化也非常敏感，環(huán)境因子的微小變化都可能引起秀麗線蟲(chóng)一系列身體特性的改變，因此，它們常被用作毒理學(xué)與環(huán)境暴露安全性評(píng)價(jià)的重要?jiǎng)游锬Ｐ蚚6-7]。本文以秀麗線蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)生物，對(duì)酒精的生殖毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究不同濃度酒精的長(zhǎng)期刺激對(duì)秀麗線蟲(chóng)生殖能力的影響，并觀察這種毒性對(duì)子代線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力造成的影響，為酒精生殖毒性的系統(tǒng)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器和線蟲(chóng)品系

乙醇（C6H5OH），北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司。Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社。Hettich MIKRO 22R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司。Sanyo MCO 175 CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo電器集團(tuán)。秀麗線蟲(chóng)品系為野生型N2，清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院薛定教授惠贈(zèng)。

1.2 線蟲(chóng)的培養(yǎng)和同期化處理

秀麗線蟲(chóng)培養(yǎng)在涂有大腸埃希菌OP50的瓊脂培養(yǎng)基（NGM）上[8]，到達(dá)產(chǎn)卵期后，將線蟲(chóng)用 20%次氯酸鈉和0.5 mol/L的氫氧化鈉處理，經(jīng)反復(fù)洗滌離心后在M9緩沖液中孵化，即獲得同期化的線蟲(chóng)。將同期化的線蟲(chóng)接種在NGM培養(yǎng)基上，20℃下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為分別含有1%、2%、3%、4%、5%酒精的實(shí)驗(yàn)組和不含酒精的空白對(duì)照組。

1.3 后代數(shù)目測(cè)定

方法參考Swain SC等[9]的報(bào)道，隨機(jī)挑取L4期線蟲(chóng)到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的NGM培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基1條，20℃下培養(yǎng)，每隔12小時(shí)轉(zhuǎn)板一次，將線蟲(chóng)挑至新的含有對(duì)應(yīng)濃度酒精的NGM培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束，統(tǒng)計(jì)每塊NGM培養(yǎng)基上后代的數(shù)目。

1.4 子宮內(nèi)受精卵數(shù)目測(cè)定

將同期化的線蟲(chóng)分別接種在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的NGM培養(yǎng)基上，線蟲(chóng)進(jìn)入產(chǎn)卵期后，隨即挑取線蟲(chóng)至無(wú)OP50的NGM培養(yǎng)基上，滴加新配制的線蟲(chóng)裂解液到蟲(chóng)體，待蟲(chóng)體被裂解，體內(nèi)受精卵暴露，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)受精卵的數(shù)目[10]。

1.5 單側(cè)性腺臂卵母細(xì)胞數(shù)目測(cè)定

將同期化的線蟲(chóng)分別接種在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的NGM培養(yǎng)基上，產(chǎn)卵期結(jié)束后，隨機(jī)挑取線蟲(chóng)至載玻片上，滴加NaN3溶液至蟲(chóng)體，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)單側(cè)性腺臂遠(yuǎn)端loop區(qū)到性腺臂近端納精囊之間卵母細(xì)胞的數(shù)目[11]。

1.6 排卵速率測(cè)定

方法同1.3后代數(shù)目測(cè)定，隨機(jī)挑取L4期線蟲(chóng)到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的NGM培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基1條，20℃下培養(yǎng)，每12小時(shí)轉(zhuǎn)板一次，排除首次和末次NGM培養(yǎng)基上后代，計(jì)算排卵過(guò)程中線蟲(chóng)的平均排卵速率。

1.7 子代線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)頻率測(cè)定

頭部擺動(dòng)頻率 （thrashes）的測(cè)定主要參照Tsalik ET和Hobert O[12]的方法，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的子代L4期線蟲(chóng)分別挑至不含酒精和OP50的NGM培養(yǎng)基上，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)1min內(nèi)線蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)。

1.8 子代線蟲(chóng)身體彎曲頻率測(cè)定

身體彎曲頻率（body bends）的測(cè)定主要參照Tsalik EL和Hobert O[12]的方法，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的子代L4期線蟲(chóng)分別挑至不含酒精和OP50的NGM培養(yǎng)基上，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)1min內(nèi)線蟲(chóng)身體彎曲次數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Microsoft office Excel 2003軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，并且用配對(duì)t檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)后代數(shù)目的改變

與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期暴露在酒精濃度為1%條件下，線蟲(chóng)的后代數(shù)目無(wú)顯著性變化，2%、3%、4%、5%條件下線蟲(chóng)后代數(shù)目明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)的后代數(shù)目

2.2 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)子宮內(nèi)受精卵數(shù)目的改變

與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期暴露在酒精濃度為1%條件下，線蟲(chóng)子宮內(nèi)受精卵數(shù)目無(wú)顯著性變化，2%、3%、4%、5%條件下線蟲(chóng)子宮內(nèi)受精卵數(shù)目明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)子宮內(nèi)受精卵數(shù)目

2.3 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)單側(cè)性腺臂卵母細(xì)胞數(shù)目的改變

與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期暴露在酒精濃度為1%條件下，線蟲(chóng)單側(cè)性腺臂卵母細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著性變化，2%、3%、4%、5%條件下線蟲(chóng)單側(cè)性腺臂卵母細(xì)胞數(shù)目明顯降低 （P<0.05），見(jiàn)圖 3。

圖3 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)單側(cè)性腺臂卵母細(xì)胞數(shù)目

2.4 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)排卵速率的改變

與對(duì)照組相比，長(zhǎng)期暴露在酒精濃度為1%、2%條件下，線蟲(chóng)的排卵速率無(wú)顯著性變化，3%、4%、5%條件下線蟲(chóng)的排卵速率明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲(chóng)的排卵速率

2.5 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率的改變

與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的子代線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率均有明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖 5。

圖5 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率

2.6 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲(chóng)的身體扭動(dòng)頻率的改變

與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組的子代線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率均有明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖 6。

3 討論

傳統(tǒng)的生殖毒性實(shí)驗(yàn)常選用大鼠、小鼠等嚙齒類(lèi)哺乳動(dòng)物，性成熟時(shí)間6~8周，妊娠期約3周，哺乳期約3周，每胎產(chǎn)仔約8~10只，繁殖周期長(zhǎng)。L4期線蟲(chóng)約18 h發(fā)育為產(chǎn)卵期成蟲(chóng)，產(chǎn)卵期約3~4 d，產(chǎn)卵約280~300個(gè)。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，應(yīng)用線蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)具有周期短、成本低優(yōu)點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境毒性研究方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：秀麗隱桿線蟲(chóng)長(zhǎng)期暴露在濃度分別為2%到5%的酒精中，后代數(shù)目、子宮內(nèi)受精卵的數(shù)目、性腺單側(cè)臂卵母細(xì)胞的數(shù)目均有不同幅度的降低，說(shuō)明酒精對(duì)線蟲(chóng)的生殖功能造成了一定程度的損傷。其中酒精濃度由低到高的各實(shí)驗(yàn)組后代數(shù)目較對(duì)照組分別減少了1.8%、3.2%、41.1%、69.1%、75.4%，隨著酒精濃度升高，產(chǎn)卵數(shù)目明顯降低，從宏觀上直接反映了酒精對(duì)線蟲(chóng)生殖系統(tǒng)造成的損傷。

由于本研究使用的是雌雄同體的線蟲(chóng)，因此線蟲(chóng)的受精卵是卵子和精子在體內(nèi)通過(guò)受精過(guò)程產(chǎn)生的。在線蟲(chóng)正常的生殖過(guò)程中，卵母細(xì)胞從單側(cè)性腺臂遠(yuǎn)端loop區(qū)到性腺臂近端納精囊之間是緊密排列并與體細(xì)胞充分接觸，并且由遠(yuǎn)及近，體積會(huì)逐漸增大[13]，而實(shí)驗(yàn)觀察到，線蟲(chóng)卵母細(xì)胞數(shù)目減少的同時(shí)，卵母細(xì)胞的大小形態(tài)也發(fā)生了一定程度的變化，導(dǎo)致細(xì)胞的排列并不像對(duì)照組一樣緊密，而是出現(xiàn)了一定的間隙。有報(bào)道表明，卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)主要依靠從性腺粗線區(qū)域向近端性腺延伸的細(xì)胞流向其輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14]，而細(xì)胞間接觸在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向卵母細(xì)胞傳遞過(guò)程中起到一定作用[15]。實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)胞間隙的出現(xiàn)可能影響到了正常的營(yíng)養(yǎng)傳輸，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞的發(fā)育受到抑制，這也是直接導(dǎo)致子宮內(nèi)受精卵數(shù)目降低的原因之一。

圖6 長(zhǎng)期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲(chóng)的身體扭動(dòng)頻率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，酒精濃度由低到高的各組受精卵數(shù)目較對(duì)照組分別減少 7.6%、26.6%、41.8%、58.2%、74.7%，卵母細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組分別減少7.7%、15.4%、15.4%、23.1%、30.8%，受精卵數(shù)目減少趨勢(shì)明顯高于卵母細(xì)胞數(shù)目減少趨勢(shì)。筆者推測(cè)酒精可能對(duì)線蟲(chóng)精子的產(chǎn)生也造成了損傷并可能影響到了線蟲(chóng)的受精過(guò)程，從而導(dǎo)致了受精卵數(shù)目的大幅下降。

排卵速率實(shí)驗(yàn)中，濃度分別為3%、4%、5%的實(shí)驗(yàn)組線蟲(chóng)排卵速率為每小時(shí)2.88個(gè)、1.78個(gè)、1.79個(gè)，較對(duì)照組有明顯降低，同時(shí)我們觀察到個(gè)別線蟲(chóng)母體內(nèi)出現(xiàn)了少量已經(jīng)孵化的幼蟲(chóng)，這些現(xiàn)象的出現(xiàn)表明較高濃度酒精刺激下的線蟲(chóng)不能正常的將受精卵排出體外，同時(shí)因此筆者推斷酒精對(duì)線蟲(chóng)的排卵功能也會(huì)造成一定程度的損傷。

針對(duì)子代線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的實(shí)驗(yàn)中，不同濃度實(shí)驗(yàn)組的子代線蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)速率和身體扭動(dòng)速率較對(duì)照組均有顯著降低，筆者推斷線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)功能可能也受到了酒精的抑制。但是由于子代線蟲(chóng)是在孵化后挑至無(wú)酒精的NGM培養(yǎng)基上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此不能確定線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的降低是因?yàn)榫凭谏硶r(shí)期對(duì)受精卵造成的損傷還是孵化后子代線蟲(chóng)短期接觸酒精而受到的神經(jīng)抑制，具體機(jī)制有待于我們繼續(xù)研究。而且由于線蟲(chóng)和人類(lèi)之間存在物種差異以及在量效關(guān)系轉(zhuǎn)化等方面尚不完善，因此結(jié)果的合理外推還需要進(jìn)行大量的后續(xù)研究。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)中線蟲(chóng)經(jīng)歷了L1~L4的幼蟲(chóng)期（相當(dāng)于人的幼年時(shí)期）以及產(chǎn)卵期，實(shí)現(xiàn)了酒精的長(zhǎng)期暴露，而且酒精通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞和受精卵的損傷、對(duì)受精作用和排卵功能的抑制等方面降低了線蟲(chóng)的生殖能力，表明長(zhǎng)期酒精暴露對(duì)線蟲(chóng)具有生殖毒性，為研究長(zhǎng)期飲酒對(duì)人類(lèi)生殖系統(tǒng)的損傷作用提供了參考。同時(shí)線蟲(chóng)在酒精生殖毒性實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)出的短周期、低成本和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，也再次驗(yàn)證了線蟲(chóng)作為一種模式生物在環(huán)境毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。

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