超濾配合LC-MS/MS法測定普伐他汀人血漿蛋白結合率

謝展雄，陳桂紅，彭巧華，吳鐵松，溫中明（.深圳龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院，廣東 深圳 58000；.深圳寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院，廣東 深圳 58000；.深圳光明新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 58000）

普伐他汀鈉（Pravastatin sodium，結構見圖1 A）是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）抑制劑，通過競爭性抑制膽固醇合成中的關鍵限速酶HMG-CoA還原酶從而影響羥甲基戊二酰輔酶A還原成羥甲戊酸（MVA），使膽固醇在肝細胞內合成減少，適用于飲食限制仍不能控制的原發(fā)性高膽固醇血癥或合并有高甘油三酯血癥的患者（Ⅱa和Ⅱb型）[1-2]。由于肝臟是合成膽固醇的最主要場所，普伐他汀鈉因水溶性特點而對肝細胞具高度的選擇性，在膽固醇生物合成中發(fā)揮較強的HMG-CoA還原酶的抑制作用，從而明顯降低血中膽固醇含量[3]。但普伐他汀在血中蛋白結合率高，以蛋白結合型的藥物存在血中會影響其跨膜運轉，從而影響其在肝細胞中的分布。因此，普伐他汀血漿蛋白結合率對其臨床療效有一定影響。已有研究報道應用高效液相色譜串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）法檢測人血中的普伐他汀鈉濃度[4-6]，但并未見LC-MS/MS法應用于普伐他汀鈉血漿蛋白結合率研究，筆者現(xiàn)探討如下。

圖1 普伐他汀鈉和瑞舒伐他汀結構式A.普伐他汀鈉；B.瑞舒伐他汀Fig 1 Structure of pravastatin sodium and rosuvastatinA.pravastatin sodium；B.rosuvastatin

1 材料

1.1 儀器

Waters Quattro Micro液-質聯(lián)用儀，配有電噴霧電離（ESI）（美國Waters公司）；Waters 2695高效液相色譜儀，包括四元泵，PAD二極管陣列檢測器、自動進樣器、Masslynx 4.02工作站（美國Waters公司）；M37610-33渦旋混合器（美國Thermo Scientific公司）；Sigma 2-16 K臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Sartorius BP 211 D型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；HGC-96 A氮吹儀（上海禾工科學儀器有限公司）；DK-S23型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；Milli-Q純水機（美國Millipore公司）；Amicon Ultra-30離心超濾管（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

普伐他汀鈉對照品（批號:20110612，純度＞98%）、瑞舒伐他?。▋葮耍?20100609，純度＞99%，結構式見圖1 B）均購于上海研晶生物科技有限公司；普伐他汀鈉片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號:20111026，規(guī)格:每片20 mg）。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜柱:Waters XTerra MS C18（150mm×2.1mm，5μm）；Waters Symmetry C18保護柱（20 mm×3.9 mm，5 μm）；流動相:甲酸銨（含0.2%甲酸）-乙腈（60∶40，V/V）；柱溫:40℃；流速:0.3 ml/min；全波長掃描。

ESI:正離子模式檢測；毛細管電壓:3.50kV；錐孔電壓:70.00 V；其人二級錐孔電壓:3.00 V；六級桿透鏡電壓:0.3 V；離子源溫度:100℃；脫溶劑氣溫度:350℃；錐孔氣流量:50 L/h；脫溶劑氣流量:450 L/h。選擇質核比范圍:100～1500 m/z，掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM），檢測通道為普伐他汀鈉m/z 448.2→327.7和瑞舒伐他汀（內標）m/z 483.2→258.6。數(shù)據(jù)由Masslynx 4.02（美國Waters公司）獲得和處理。普伐他汀鈉和內標的離子掃描圖譜見圖2。

圖2 產物離子掃描圖譜A.普伐他汀鈉；B.瑞舒伐他汀Fig 2 Product ion scan spectraA.pravastatin sodium；B.rosuvastatin

2.2 標準溶液的制備

準確稱取普伐他汀鈉和內標瑞舒伐他汀各1.0 mg，加甲醇分別溶解于100 ml量瓶中，作為儲備母液（普伐他汀鈉質量濃度10.0 μg/ml，瑞舒伐他汀質量濃度10.0 μg/ml），于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ∑辗ニ♀c儲備母液用甲醇依次稀釋成1.25、3.75、10.00、25.00、50.00、125.00 ng/ml系列濃度作為標準工作溶液，于4℃冰箱保存待用；將瑞舒伐他汀儲備母液稀釋成200.0 ng/ml作為工作溶液，于4℃冰箱保存待用。低、中、高3個（1.25、10.00、125.00 ng/ml）質量濃度的普伐他汀鈉標準工作溶液作為質控（QC）樣本以備后用。

2.3 血漿樣品的處理

健康志愿者給藥前抽取靜脈血5 ml作為空白對照；給藥后1、2、4、6、12、24 h時分別分部分抽取靜脈血5 ml，所取全血即時離心制備血漿，存儲于－20℃冰箱。待測血漿樣品從冰箱取出，于37℃解凍。A部分:微量加樣器精密吸取500 μl置離心超濾管中，12000 r/min離心10 min；濾液加內標工作溶液100 μl，渦旋5 min，置另一離心管中，30℃水浴氮氣吹干；殘留物加流動相150 μl復溶，12000 r/min離心10 min，得上清液即為游離型藥物血漿樣品；吸取10 μl進樣分析。B部分:微量加樣器精密吸取500 μl置另一10 ml的離心管中，加內標工作溶液100 μl，加入 100 mmol/L甲酸銨 100 μl，渦旋1 min，再加入叔丁基甲基醚5 ml，渦旋5 min，3000 r/min離心10 min；上清液置另一離心管中，30℃水浴氮氣吹干，殘留物加流動相150 μl復溶，12000 r/min離心10 min，得上清液即為總的藥物血漿樣品；吸取10 μl進樣分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線的制備和定量限考察:取空白血漿250 μl，加入普伐他汀鈉系列工作溶液50 μl，配成相當于普伐他汀鈉血漿濃度為0.25、0.75、2.00、5.00、10.00、50.00 ng/ml的血漿樣品，分別按“2.3”項下A部分和B部分方法處理，并進樣分析。記錄峰面積，以待測物濃度（x）為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值（y）為縱坐標，用加權最小二乘法進行線性回歸，得游離型、總的藥物檢測的標準曲線方程分別為y＝0.0277123 x－0.0100645（r＝0.9995）、y＝0.0212767 x+0.0006445（r＝0.9985）。結果表明，普伐他汀鈉血藥濃度分別在0.25～50.00 ng/ml、25.00～50.00 ng/ml范圍內線性關系良好；定量限為0.25 ng/ml。

2.4.2 專屬性:分別將空白血漿、空白加樣、游離型血漿樣品和總藥物型血漿樣品分別按“2.3”項下相對應的方法處理，進樣分析，結果見圖3。在MRM模式下，血漿中普伐他汀鈉和瑞舒伐他?。▋葮耍┠軌蚝芎玫胤蛛x，峰形良好，無血漿內源性物質峰干擾。其保留時間分別為普伐他汀鈉1.0 min和瑞舒伐他汀1.3 min。

圖3 MRM模式下典型色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+普伐他汀鈉對照品+內標；C.游離型血漿樣品；D.總藥物型血漿樣品；1.普伐他汀鈉；2.瑞舒伐他汀Fig 3 The typical chromatograms in MRM modeA.blank plasma；B.blank plasma+pravastatin sodium control+internal standard；C.free type plasma sample；D.whole type plasma sample；1.pravastatin sodium；2.rosuvastatin

2.4.3 方法精密度:分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質量濃度的QC樣本溶液50 μl，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理。同一質量濃度樣品于同一天連續(xù)進樣6次，進行日內精密度分析；同一質量濃度樣品于連續(xù)3 d進樣，進行日間精密度分析。其所得RSD值的范圍為5.0%～13.4%，說明方法精密度良好，結果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.4.4 方法回收率:分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質量濃度的QC樣本溶液50 μl，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，記錄峰面積，計算濃度。與相對應的QC樣本溶液進行比較，得方法的平均加樣回收率，A部分方法處理:95.2%、87.2%和90.4%，B部分方法處理:87.5%、88.2%和90.7%，詳見表1。

2.4.5 絕對回收率和基質效應:分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質量濃度的QC樣本溶液50 μl，分別按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，進樣分析，記錄峰面積。與上述QC樣本溶液直接進樣分析所得峰面積進行比較，其所得絕對回收率為（99.4±1.7）%、（99.6±1.6）%、（98.1±2.7）%（A部分方法處理）和（97.1±1.9）%、（98.4±2.2）%、（99.1±2.6）%（B部分方法處理）。QC樣本溶液直接進樣分析所得峰面積計算所得濃度與QC樣本溶液實際濃度比較即為基質效應，其RSD值分別為13.2%、10.1%、7.8%（A部分方法處理），5.2%、8.5%、6.1%（B部分方法處理），符合藥物體內分析方法的規(guī)定。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗:分別取空白血漿250 μl，加入高、中、低3個質量濃度的QC樣本溶液50 μl，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，分別于室溫放置8 h，－20℃放置2周及2個凍融循環(huán)，檢測放置前后濃度變化。結果，在3種貯存條件下，各濃度樣品未見明顯的變化。濃度前后變化的偏差小于±15%。說明樣品在正常貯存條件下是穩(wěn)定的。

2.5 蛋白結合率

6名健康成人志愿者空腹口服給藥（20 mg）后按上述時間間隔抽取靜脈血，按“2.3”項下A部分和B部分方法分別處理，并進樣分析。普伐他汀鈉蛋白結合率＝（總的普伐他汀鈉血漿濃度－游離型普伐他汀鈉血漿濃度）/總的普伐他汀鈉血漿濃度。1、2、4、6h時結果分別（50.5±5.7）%、（51.2±3.5）%、（49.8±6.8）%、（52.4±10.1）%。

3 討論

藥物血漿蛋白結合率是藥物與血漿蛋白結合的量占藥物總濃度的百分率，是藥動學的重要參數(shù)之一。它影響藥物在體內的分布、代謝與排泄，從而影響其作用強度和時間，并往往與藥物的相互作用及作用機制等密切相關。因此，藥物血漿蛋白結合率的研究無論對于新藥研究開發(fā)還是指導臨床合理用藥都具有重要意義。本試驗利用超濾方法處理樣品配合靈敏的LC-MS/MS法檢測而得游離型普伐他汀血漿濃度，并與溶劑法處理所得總的藥物濃度相比較。所得結果可以看出不同時間普伐他汀血漿蛋白結合率約50%左右，保持一種較穩(wěn)定的狀態(tài)，其原因可能是隨著藥物被機體不斷代謝，與血漿蛋白結合的藥物又不斷游離出來，從而使游離型和結合型的藥物比例保持相對不變。普伐他汀的血漿清除半衰期約為1.5～2 h左右，由于普伐他汀被機體代謝的原因，志愿者一次性口服給藥后12 h和24 h的時間點未能檢出普伐他汀，因此，無法計算這2個時間點的血漿蛋白結合率。

超濾是一種篩孔分離過程，主要用來截留分子質量高于500的物質。通過高速離心所施加的壓力讓游離的藥物濾過，而大分子的蛋白和藥物和蛋白結合物也被除去。其本身有去除蛋白的作用。但超濾法的使用時因、壓力問題而造成部分結合型藥物又游離出來，從而對結果產生一定影響。

本文應用超濾和溶劑法處理血漿樣品配合LC-MS/MS檢測技術，建立了一種專屬性強、準確度高、簡單快速的普伐他汀鈉的臨床血藥濃度檢測方法，通過檢測游離型的藥物濃度和血中總的藥物濃度，可用于測定其在健康志愿者血中的蛋白結合率。

[1]毛利東.普伐他汀的藥理作用及臨床應用[J].中國實用醫(yī)藥，2010，5（15）:180.

[2]宋少岡，陶金成，吳建龍，等.普伐他汀調節(jié)冠心病患者血脂及血壓的臨床觀察[J].中國藥房，2005，16（22）:1725.

[3]Shiomi M，Ito T，Tsukada T，et al.Reduction of serum cholesterol levels alters lesional composition of atherosclerotic plaques.Effect of pravastatin sodium on atherosclerosis in mature WHHL rabbits[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15（11）:1938.

[4]鄧鳴，劉會臣，薛洪源，等.HPLC-MS法同時測定人血漿中普伐他汀及其主要代謝物3′α-異普伐他汀[J].藥物分析雜志，2005，25（2）:160.

[5]譚志榮，歐陽冬生，周淦.簡單靈敏的LC-MS/MS方法檢測人血漿中普伐他汀的濃度[J].中國新藥雜志，2008，17（13）:1150.

[6]張敏，譚志榮，陳豪.LC-MS/MS方法檢測人血漿中普伐他汀的濃度約[J].藥物分析雜志，2009，29（1）:58.