不同食品基質(zhì)中單核細胞增生李斯特氏菌核酸提取方法的比較

周 陽 ， 祝長青 ， 郭云昌 ， 郭桂萍 ， 蔣 原 ， 劉秀梅 ， 付瑞燕 *

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥 230000；2.安徽省食品安全分析與檢測省級實驗室，安徽 合肥230000；3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；4.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

從20世紀90年代起，單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）就被世界衛(wèi)生組織列出的最重要食源性病原菌之一[1-2]。該菌多存在于土壤、人和動物的糞便中，極易污染食品并引起人和動物的李斯特菌病，臨床上多表現(xiàn)為人和動物腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀，妊娠期婦女、新生兒及免疫功能低下者均為易感人群[3]。該病發(fā)病率低，但臨床死亡率高。近年來，多次發(fā)生由單核細胞增生李斯特氏菌引起的食源性疾病的暴發(fā)并造成部分患者的死亡，引起世界各國高度關注[4-5]。

隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展和人民群眾生活質(zhì)量的提高，無論是生產(chǎn)企業(yè)中生產(chǎn)流程的監(jiān)測和終產(chǎn)品的質(zhì)量控制，還是政府部門對食品安全的監(jiān)管，都迫切需要快速的食源性致病菌檢測方法以滿足食品檢驗的時效性。目前，單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，操作繁瑣，耗時長，不能實現(xiàn)快速篩檢[6]。當食品中單核細胞增生李斯特氏菌數(shù)目很少時，傳統(tǒng)培養(yǎng)法還可能出現(xiàn)假陰性結果。而分子生物學檢測技術的快速發(fā)展為食源性致病菌的快速鑒定提供了可能，常規(guī)聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法、實時熒光PCR（real-time PCR）方法、多重PCR等相繼建立并得到更多的應用和推廣[7]。DNA模板的質(zhì)量是影響分子生物學檢測技術的準確性和重復性的重要因素，而樣品DNA模板的質(zhì)量又與食品基質(zhì)類型以及核酸提取方法密切相關。因此作者以單核細胞增生李斯特氏菌為研究對象，選取肉類、海產(chǎn)品、奶制品、果蔬類4種典型食品基質(zhì)，利用4種原理不同的提取方法進行核酸提取，通過實時熒光PCR法進行實際的評估，確定出靈敏度高、穩(wěn)定性好的通用方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 實驗菌株 單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株CMCC 54004：菌株由江蘇出入境檢驗檢疫局購買并保存，菌株來源中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基及耗材 單核細胞增生李斯特氏菌增菌肉湯LB1/LB2：北京陸橋；胰蛋白胨大豆瓊脂：TSA，美國OXOID；胰蛋白胨大豆營養(yǎng)肉湯：TSB，美國OXOID；PALCAM瓊脂：美國OXOID；李斯特顯色培養(yǎng)基：法國科瑪嘉；1.5 mL和15 mL的無菌離心管；帶濾網(wǎng)的勻質(zhì)袋；一次性10 mL和2 mL移液管等。

1.1.3 試劑 溶菌酶10 mg/mL；蛋白酶K 20 mg/mL；TE 溶液：10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0），高壓滅菌；異丙醇、75%乙醇、無水乙醇、50 mmol/L EDTA溶液；細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱）:天根公司 Cat.#DP302；Promega 沉降法試劑盒:Wizard○RGenomic DNA Purification Kit，Cat.#A1125；Promega 磁珠吸附法試劑盒：Wizard○RMagnetic DNA Purification Systerm For Food，Cat.#FF3750；Chelex-100 提取液：5%Chelex-100，0.5%NP40，TE配制，pH 8~9；單核細胞增生李斯特氏菌熒光PCR檢測試劑盒：上海輝睿生物科技有限公司，Cat.#BD-I-303。

1.1.4 儀器 恒溫振蕩金屬浴：博日MB-102；高速離心機：Thermo Scientific Biofuge Stratos；實時熒光PCR擴增儀：Roche LightCycler 480Ⅱ；電動移液器。1.1.5 試驗樣品 從超市中購買新鮮試驗樣品鹽水鴨、三文魚、鮮牛奶、水果蔬菜色拉各兩份，每份100 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 陰性試驗樣品的確認 按照國家食品安全標準GB 4789.30-2010[8]對檢測樣品進行增菌，然后利用實時熒光PCR方法對增菌液進行快速篩選，同時涂布PALCAM瓊脂和李斯特顯色培養(yǎng)基平板進行菌落分離，對陰性試驗樣品進行確認，用于后期實驗。

1.2.2 陰性樣品增菌培養(yǎng)以及標準菌株增菌液的準備 將陰性樣品用LB1增菌液進行增菌，（30±1）℃培養(yǎng)24 h。從LB1增菌后的菌液吸取1 mL至盛有 100 mL LB2增菌液的錐形瓶中，（30±1）℃培養(yǎng)24 h；同時，用胰蛋白胨大豆營養(yǎng)肉湯對標準菌株CMCC 54004進行增菌，（37±1）℃培養(yǎng) 24 h。

1.2.3 細菌梯度稀釋液的制備 從 （37±1）℃培養(yǎng)24 h的標準菌株增菌液中吸取1 mL進行10倍稀釋（增菌液在稀釋前應注意用振蕩器將菌懸液充分振勻）。吸取100 μL 10-5~10-7梯度稀釋菌液（涂布前必須將其充分混勻），均勻涂布胰蛋白大豆瓊脂（TSA瓊脂），每個梯度涂布三塊平板，（37±1）℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)取平均值。

1.2.4 樣品（陰性增菌液）布菌 在1.5 mL的離心管中加入900 μL樣品增菌液和100 μL標準菌株增菌液（分裝前樣品增菌液和標準菌株增菌液均需充分混勻），振蕩離心（12 000 g離心 10 min），棄上清液，沉淀可-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 核酸提取 實驗中沉降法選取Promega沉降法試劑盒，操作步驟按照產(chǎn)品說明書執(zhí)行；磁珠法選取Promega磁珠吸附法試劑盒，操作步驟按照產(chǎn)品說明書執(zhí)行；離心柱法選取天根公司的“細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱）”，操作步驟按照產(chǎn)品說明書執(zhí)行；裂解法選取Chelex-100法[9]操作步驟：向沉淀中加入100 μL Chelex-100提取液，56℃孵育10 min，100℃水浴5 min，冰上冷卻，12 000 g離心2 min，取上清液用于檢測。

1.2.6 實時熒光PCR反應 選用單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光PCR檢測試劑盒對提取的核酸進行評估。總反應體系25 μL：包括12.5 μL單增李斯特PCR反應液Ⅰ，4 μL單增李斯特PCR反應液Ⅱ，3.5 μL 滅菌蒸餾水，5.0 μL DNA 模板。 反應程序為：95℃預變性10 min，1個循環(huán)；95℃變性10 s，58℃復性45 s，收集熒光信號，50個循環(huán)；40℃冷卻40 s，1個循環(huán)。將3次平行試驗反應結束后的Ct值取平均值，然后進行分析。

1.2.7 4種方法在純菌核酸提取效果的比較 如上1.2.2、1.2.3所述，再次對標準菌株進行增菌，24 h后制備細菌梯度稀釋液，平板計數(shù)。將100 μL的各稀釋度的增菌液分裝至1.5 mL的無菌離心管中，12 000 g離心10 min后棄上清液，然后用4種方法提取核酸，應用實時熒光PCR進行檢測。

2 結果與分析

2.1 標準菌株平板計數(shù)結果

第一次平板計數(shù)結果：100 μL純菌菌液經(jīng)107倍稀釋后的平板計數(shù)平均值為145，所對應細菌數(shù)量級為102；經(jīng)106倍稀釋后的平板計數(shù)平均值為1 394，所對應細菌數(shù)量級為103。4種方法在純菌核酸提取效果比較實驗中的平板計數(shù)結果：100 μL純菌菌液經(jīng)106倍稀釋后的平板計數(shù)平均值為56，所對應細菌數(shù)量級為101；經(jīng)105倍稀釋后的平板計數(shù)平均值為548，所對應細菌數(shù)量級為102。

2.2 實時熒光RT-PCR反應結果

2.2.1 鹽水鴨基質(zhì)中四種核酸提取方法的比較由圖1可以看出，PCR反應的陰性、陽性對照正常，擴增曲線典型。 由表1可知，細菌數(shù)量級在105時，Promega沉降法、Promega磁珠法、天根離心株法以及Chelex的3次平行試驗的平均Ct值分別為33.62、36.55、38.80、0。試驗結果顯示，在鹽水鴨干擾基質(zhì)中，Promega沉降法靈敏度最好；Promega磁珠法也有較好的靈敏度；天根離心柱法次之；而Chelex-100法靈敏度很差，不能排除干擾基質(zhì)的影響，不適合該基質(zhì)中單核細胞增生李斯特氏菌核酸提取。

圖1 鹽水鴨基質(zhì)中RT-PCR擴增曲線Fig.1 Real-time PCR amplification curve in salted duck matrix

表1 鹽水鴨基質(zhì)四種核酸提取方法Ct值Table 1 Ctvalue of four nucleic acid extraction method in salted duck matrix

2.2.2 三文魚基質(zhì)中4種核酸提取方法的比較由圖2可以看出，PCR反應的陰性、陽性對照正常，擴增曲線典型。由表2可知，細菌數(shù)量級在105時，Promega沉降法、Promega磁珠法、天根離心株法以及Chelex的3次平行試驗的平均 Ct值分別為34.40、36.95、38.45、0。試驗結果顯示，在三文魚干擾基質(zhì)中，Promega沉降法具有較高的靈敏度；天根離心柱法穩(wěn)定性好，靈敏度高；Promega磁珠法靈敏度尚可，但穩(wěn)定性不好；而Chelex-100法靈敏度差，抗干擾基質(zhì)影響的能力弱。

2.2.3 牛奶基質(zhì)中4種核酸提取方法的比較 由圖3可以看出，PCR反應的陰性、陽性對照正常，擴增曲線典型。由表3可知，細菌數(shù)量級在105時，Promega沉降法、Promega磁珠法、天根離心株法以及Chelex的3次平行試驗的平均 Ct值分別為40.44、42.72、38.64、0。 試驗結果顯示，Promega 沉降法與Promega磁珠法的靈敏度和穩(wěn)定性明顯不如天根離心柱法。雖然Chelex-100法在細菌數(shù)量級為106時是陽性，但從擴增曲線可見受到牛奶基質(zhì)的干擾很強。

圖2 三文魚基質(zhì)中RT-PCR擴增曲線Fig.2 Real-time PCR amplification curve in salmon matrix

表2 三文魚基質(zhì)四種核酸提取方法Ct值Table 2 Ctvalue of four nucleic acid extraction method in salmon matrix

圖3 牛奶基質(zhì)中RT-PCR擴增曲線Fig.3 RT-PCR amplification curve in milk matrix

表3 牛奶基質(zhì)4種核酸提取方法Ct值Table 3 Ctvalue of four nucleic acid extraction method in milk matrix

2.2.4 水果蔬菜色拉基質(zhì)中4種核酸提取方法的比較 由圖4可以看出，PCR反應的陰性、陽性對照正常，擴增曲線典型。由表4可知，細菌數(shù)量級在105時，Promega沉降法、Promega磁珠法、天根離心株法以及Chelex的3次平行試驗的平均Ct值分別為 32.66、0、37.01、0。 試驗結果顯示 Promega沉降法具有較高的靈敏度，穩(wěn)定性好；天根離心柱法穩(wěn)定性好，靈敏度高；Promega磁珠法靈敏度尚可，但穩(wěn)定性不好；Chelex-100法受到基質(zhì)干擾的程度較大。

圖4 水果蔬菜色拉基質(zhì)中RT-PCR擴增曲線Fig.4 Real-time PCR amplification curve in fruit and vegetables salad matrix

表4 水果蔬菜色拉基質(zhì)四種核酸提取方法Ct值Table 4 Ctvalue of four nucleic acid extraction method in fruit and vegetables salad matrix

2.2.5 純菌增菌液中四種核酸提取方法的比較由圖5可以看出，PCR反應的陰性、陽性對照正常，擴增曲線典型。由表5可知，Chelex-100法對純菌核酸提取的效果最好，靈敏度、穩(wěn)定性都很好，天根離心柱法次之，Promega磁珠法和沉降法均不如前兩種方法。結果證實Chelex-100法非常適合純菌增菌液或單菌落核酸的快速提取，但是不適合在復雜食品基質(zhì)的增菌液中應用。

圖5 純菌液核酸RT-PCR擴增曲線Fig.5 Real-time PCR amplification curve in pure bacteria liquid

表5 純菌增菌液四種核酸提取方法Ct值Table 5 Ctvalue of four nucleic acid extraction method in pure bacteria liquid

3 結語

我國居民的飲食結構中，即食食品所占比例越來越多，包括肉類、奶制品、水產(chǎn)品、水果蔬菜等，并且成為了單核細胞增生李斯特氏菌的重要感染源。此外，該菌在4℃條件下也可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌。隨著我國冷藏食品消費量的增多，單核細胞增生李斯特氏菌的潛在危險性也越來越突出，因此單核細胞增生李斯特氏菌的檢測工作顯得尤為重要。

食源性致病菌的檢測中，食品種類的多樣性對檢測結果的影響是需要著重考慮的重要問題之一。不同類型食品的組成成份差異較大，如肉類中含有較多的蛋白質(zhì)、脂肪、無機鹽和維生素，魚肉含有大量優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，不飽和脂肪酸及豐富的維生素A和維生素D，奶制品中含有較多脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)、乳糖、無機鹽，青菜中含有膳食纖維和多種維生素，這些食品的組份會不同程度的影響單增李斯特氏菌核酸提取效果，此外食品在處理和加工過程中所添加的部分成份對核酸提取過程也會產(chǎn)生影響。由于食品組份的不同，會對檢測過程中單增李斯特氏菌的核酸提取以及實時熒光PCR檢測也會產(chǎn)生不同程度的影響，因此需對不同食品選擇合適的核酸提取方法，盡量減小食品基質(zhì)中復雜成份對檢測的影響，保證檢測結果的可靠性。

實驗中選取4種不同的核酸提取方法，其原理各不相同。離心柱法多采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和特殊的緩沖液系統(tǒng)提取細菌核酸，可以高效、專一吸附DNA，最大限度的去除蛋白質(zhì)及細胞中其他有機化合物；磁珠法具有獨特分離作用的磁珠和緩沖液系統(tǒng)，能夠特異性吸附核酸，當條件改變時又可以釋放核酸，吸附后的漂洗過程還可將溶液中的PCR抑制物洗去；沉降法常采用細胞裂解液和相關酶類裂解細菌，用酚或氯仿去除脂類分子、多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)以及包含DNA水相中的核酸酶，用乙醇等沉降DNA并去除鹽及殘留的氯仿等成份；Chelex-100是一種由苯乙烯、二乙烯共聚體組成化學螯合樹脂，對高價金屬離子有很高的親合力和螯合作用，在低離子強度、堿性及煮沸條件下，可以使細胞膜破裂，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，促進DNA游離。

本次試驗為了將4類核酸提取方法進行較好比較，直接將不同食品基質(zhì)的增菌液與不同濃度單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株菌液混合均勻，然后進行核酸提取方法的比較，使問題進一步具體化、形象化，便于比較。研究表明：不同食品基質(zhì)對核酸提取方法提取效果的干擾程度差異性不同，如果在提取過程中不能有效的去除就會影響實時熒光PCR方法的準確性，導致一些假陰性結果的出現(xiàn)。肉類基質(zhì)比較復雜，油脂及蛋白類物質(zhì)較多，核酸提取的難度較大，離心柱法、沉降法和磁珠法的靈敏度較高，核酸提取效果較好，并且離心柱法的穩(wěn)定性明顯高于沉降法和磁珠法，抗干擾能力強；海產(chǎn)品和水果蔬菜色拉基質(zhì)中干擾因素相對較少，離心柱法和沉降法比較適合；對于奶制品基質(zhì)，離心柱法能較好的排除大量蛋白類成份的影響，保證檢測的準確性。此外，從操作方面考慮，沉降法和磁珠法操作比較繁瑣，對操作人員的要求較高，可能會因某些步驟的操作不當而造成核酸的大量損耗，影響核酸提取效率以及檢測結果的準確性。離心柱法操作簡單，對實驗人員的技術與操作經(jīng)驗要求不高，易于掌握，雖然在核酸提取過程中也存在部分損耗，但提取效率相對較高。Chelex-100法操作步驟簡單，減少了DNA的損失和污染的機會，但是抗基質(zhì)干擾的能力很差，檢測結果極易受到基質(zhì)的影響，不能有效去除PCR反應的干擾因子，對復雜食品基質(zhì)中核酸提取效果差，僅適用于純菌的核酸提取。

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