呋喃唑酮人工抗原的制備與鑒定

徐麗廣， 匡 華， 宋珊珊， 胡擁明， 黃佳佳， 胥傳來

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

硝基呋喃類藥物（nitrofurans）主要是指呋喃唑酮（furazolidone）、呋喃它酮（furmtadone）、呋喃西林（nitrofurazone）、呋喃妥因（nitrofurantoin）等含有硝基的人工合成抗菌藥物，硝基呋喃有非常好的抗菌作用，對大多數(shù)格蘭陽性菌、格蘭陰性菌、某些真菌和原蟲有殺滅作用，且不易產(chǎn)生耐藥性、價格低廉，被廣泛用于治療和預防由埃希菌和沙門菌引起的哺乳動物消化道疾病，也被做為飼料添加劑來預防家禽的腸道傳染病[1-7]。

然而，近年來越來越多的研究表明，硝基雜環(huán)類化合物具有細胞誘變性、動物致癌毒[8-14]?？茖W家已經(jīng)證實，硝基呋喃及其代謝物具有誘導基因突變的慢性毒性，可引起實驗動物的發(fā)生癌變和基因突變。出于安全性考慮，美國、歐盟等國家和地區(qū)要求該類藥物不得用于畜牧養(yǎng)殖中[15-18]。歐盟對該類藥物不得檢出。我國農(nóng)業(yè)部2002文件也要求在動物源食品中不得檢出硝基呋喃類藥物。作者通過考察硝基呋喃類藥物的母核結(jié)構(gòu)，以乙醇肼和碳酸二甲酯為原料，合成了完全抗原，并采用呋喃唑酮在動物體內(nèi)的穩(wěn)定代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）的特異性抗體對抗原的性能進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA）：上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品；N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和 N－羥基丁二酰亞胺（NHS）：百靈威化學技術(shù)有限公司產(chǎn)品；乙醇肼和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）：上海晶純試劑有限公司產(chǎn)品；碳酸二甲酯，甲醇鈉和對醛基苯甲酸：上海達瑞精細化學品有限公司產(chǎn)品；其他試劑包括磷酸氫二鈉 （AR）， 磷酸二氫鈉 （AR），N，N-二甲基甲酰胺DMF（AR）等：國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；呋喃唑酮多克隆抗體：作者所在實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

酸度計：購自梅特勒-托得多（上海）儀器公司產(chǎn)品；純水儀：美國 mini-Q公司產(chǎn)品；UV-2802PC可見光度計：尤尼柯 （上海）儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；90-2型定時恒溫磁力攪拌器和WH-2微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；LCQDECA型高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國非尼根公司（Finnigan company）產(chǎn)品；DF-1型集熱式磁力攪拌水浴鍋：金壇榮華儀器有限公司產(chǎn)品；MuLtiskan Mks酶標儀和可調(diào)試移液器：美國熱電公司 （Thermo Lab systems）產(chǎn)品；ZD-9556水平搖床：太倉科教器材廠產(chǎn)品；Costar96孔8×12可拆酶標板：上海吉泰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 半抗原合成

1.3.1 3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）的合成 以碳酸二甲酯和乙醇肼為原料，合成AOZ。在有蒸餾裝置的圓底燒瓶中加入甲醇3.78 mL，甲醇鈉（30%）5.82 mL，乙醇肼6.00 mL充分攪拌20 min，加入碳酸二甲酯1.155 mL。60℃保溫1 h，緩慢攪拌升溫至75℃。緩慢蒸出甲醇，當甲醇蒸餾完畢，結(jié)束反應，得到AOZ成液。冷卻至室溫，加入無水乙醇41 mL，于4℃冰箱靜置，得到白色固體，離心后加無水乙醇重結(jié)晶3次得到AOZ。反應過程見圖1。

圖1 AOZ的合成路線Fig.1 Synthesis of AOZ

1.3.2 對醛基苯甲酸衍生物（CPAOZ）的合成 取對醛基苯甲酸0.65 g，加入純水10 mL，再加入3 mL 1 mol/L HCl；磁力攪拌下，在體系中緩慢滴加DMF，直至對醛基苯甲酸完全溶解，測定pH約為4.0左右；磁力攪拌下，加入1.3 g AOZ，溶解后，60℃下回流反應過夜，產(chǎn)生白色固體；將產(chǎn)物離心，棄上清液，將白色固體置于濾紙（放在漏斗中）上，用純水洗滌3次，氮氣吹干，得到半抗原CPAOZ，合成路線見圖2。

圖2 CPAOZ的合成路線Fig.2 Synthesis of CPAOZ

1.4 完全抗原制備

按照文獻[19-20]方法，分別采用碳二亞胺法（EDC活化）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC活化法）以及混合酸酐法（MA）將CPAOZ分別與載體蛋白BSA，OVA偶聯(lián)，制備完全抗原。采用紫外掃描儀對完全抗原進行鑒定。采用Bradford法和Lowry法對偶聯(lián)物進行偶聯(lián)物蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定。用紫外掃描儀，得到CPAOZ的最大吸收波長，在CPAOZ的最大吸收波長下分別測已知質(zhì)量濃度的偶聯(lián)物和載體蛋白質(zhì)的吸光值，并將CPAOZ、完全抗原、載體蛋白的質(zhì)量濃度根據(jù)其相對分子質(zhì)量轉(zhuǎn)換為摩爾濃度，根據(jù)式（1）計算各自的摩爾消光系數(shù)：

其中，A為吸光度，c為摩爾濃度。

根據(jù)摩爾消光系數(shù)計算完全抗原中半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)比，見式2：

1.5 酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）方法的建立

將上述3種方法制備的完全抗原做為包被抗原，采用ELISA方法進行驗證。通過系列稀釋抗原和抗體，采用方陣法確定最佳稀釋比例。以呋喃唑酮為抑制物，建立各自的ELISA抑制曲線，計算半數(shù)抑制率（IC50），比較各個抗原與抗體的匹配性。

2 結(jié)果與分析

2.1AOZ和CPAOZ的質(zhì)譜鑒定

AOZ的合成是本試驗的關(guān)鍵。將重結(jié)晶后的產(chǎn)物溶解在含有50%甲醇的水溶液中進行質(zhì)譜掃描，結(jié)果見圖3（a）。AOZ的相對分子質(zhì)量為102，在正離子模式下，可以看到明顯的分子離子峰（M+1）m/z 103，證明合成成功。同樣地，衍生后產(chǎn)物CPAOZ的相對分子質(zhì)量為208，在正離子模式下的分子離子峰（M+1）m/z 209。 從圖3（b）中可以看到明顯的m/z 209分子離子峰。 綜上，本方法成功地制備了呋喃唑酮的穩(wěn)定代謝物AOZ和半抗原CPAOZ。

圖3 AOZ和CPAOZ的質(zhì)譜表征Fig.3 Characterization using mass spectrum for AOZ and CPAOZ

2.2 完全抗原的紫外光譜鑒定

以載體蛋白OVA的偶聯(lián)物為例進行分析，圖4是采用EDC法制備的完全抗原鑒定圖譜。其中，OVA最大吸收波長為216 nm，吸收值A(chǔ)為1.378，半抗原的最大吸收波長為210 nm，偶聯(lián)物CPAOZOVA最大吸收波長為221 nm。偶聯(lián)后，紫外吸收峰發(fā)生了明顯的紅移，證明了半抗原CPAOZ與載體蛋白OVA偶聯(lián)成功。考馬斯亮藍染色法計算偶聯(lián)物中OVA的質(zhì)量濃度為5 mg/mL，根據(jù)公式（1）和（2），得到產(chǎn)物的偶聯(lián)比為8。同樣地，對DCC法制備的完全抗原進行紫外光譜鑒定，計算得偶聯(lián)比為12；混合酸酐法（MA）制備的完全抗原偶聯(lián)比為17。

圖4 CPAOZ、OVA和CPAOZ-OVA的紫外掃描圖Fig.4UV spectrum of CPAOZ，OVA and CPAOZ-OVA

AOZ是呋喃唑酮抗菌素的殘留標示物，相對分子質(zhì)量只有102，結(jié)構(gòu)簡單，不具備免疫原性。為了保護其主要抗原決定簇，采用對醛基苯甲酸在其結(jié)構(gòu)上引入了一個苯環(huán)，一方面保護了AOZ的抗原決定簇，另一方面也使得其抗原決定簇在免疫反應中得到充分暴露，被抗體識別。

2.3 ELISA測試結(jié)果

根據(jù)ELISA檢測的要求，一般選擇吸光值在1.5~1.8時的抗原抗體稀釋質(zhì)量濃度做為最適工作濃度。采用方陣滴定法確定了包被抗原和抗體的最適工作濃度。對于EDC法合成抗原最佳稀釋質(zhì)量濃度為0.09 ng/mL，抗體的稀釋質(zhì)量濃度為0.04 μg/mL。以DCC法制備的抗原為包被原，優(yōu)化后包被抗原的最佳稀釋質(zhì)量濃度為0.56 μg/mL，抗體稀釋質(zhì)量濃度為0.63 μg/mL。采用混合酸酐法（MA法）制備的抗原為包被原，則抗原的最佳稀釋質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL，抗體稀釋質(zhì)量濃度為 1.25 μg/mL。

分別在最佳抗原和抗體的稀釋濃度下以呋喃唑酮抗菌素體內(nèi)代謝物AOZ和CPAOZ建立抑制曲線，計算了各個曲線的半數(shù)抑制率，結(jié)果見表1。

表1 基于不同包被抗原的ELISA半數(shù)抑制率Table 1 IC50values for various coating antigens

從表1可知，在本試驗條件下，采用混合酸酐（MA）法制備的包被原與抗體配對，對 AOZ進行測定獲得了最低的半數(shù)抑制率IC50值，即1.1 ng/mL，而采用EDC法和DCC法時的結(jié)果為12.9 ng/mL和7.6 ng/mL，是MA法的7~10倍。然而，對于CPAOZ的最低半數(shù)抑制率為1.6 ng/mL，來自于DCC法抗原做為包被時的結(jié)果。半數(shù)抑制率（IC50）值是影響ELISA方法的關(guān)鍵參數(shù)，決定了方法的靈敏度和特異性。本研究結(jié)果表明，即使針對于同一株抗體，不同的抗原制備方法表現(xiàn)出不同的性能，這和其主要抗原決定簇的暴露程度有關(guān)。

3 結(jié)語

本研究采用了3種完全抗原的制備方法（EDC法，DCC法和MA法），制備了呋喃唑酮的代謝物AOZ衍生物CPAOZ的完全抗原。紫外光譜鑒定表明了3種方法偶聯(lián)載體蛋白均獲得了成功，偶聯(lián)比率分別為8、12、17。與AOZ抗體的配對試驗結(jié)果表明，采用MA法制備的完全抗原做為包被原時，半數(shù)抑制率（IC50）值最低，為1.1 ng/mL，表明在酶免疫分析中，此抗原可以較好地將AOZ的特征抗原決定簇暴露給抗體，這為進一步開發(fā)AOZ的抗體提供了思路。

[1]李書國，李雪梅，陳輝，等.動物性食品安全和 HACCP[J].食品科學，2003，24（8）：217-220.LI Shu-guo，LI Xue-mei，CHEN Hui，et al.The animal food safety and HACCP[J].Food Science，2003，24 （8）：217-220.（in Chinese）

[2]佟恒敏，李艷華，韓建春.我國動物性食品中獸藥殘留的現(xiàn)狀及危害[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2003，11：61-62.TONG Heng-min，LI Yan-hua，HAN Jian-chun.The current status and hazard of veterinary drug residues in animal products in China[J].Heilongjiang Journal of Animal Science and Veterinary Medicine，2003，11：61-62.（in Chinese）

[3]徐維海，林黎明，朱校斌.HPLC/MS法對呋喃唑酮及其代謝物AOZ在羅非魚體內(nèi)殘留研究[J].上海水產(chǎn)大學學報，2005，34（8）：23-25.XU Wei-hai，LIN Li-ming，ZHU Xiao-bin.The research of residues of furazolidone and its metabolite in tilapias by HPLC/MS[J].Journal of Shanghai Fisheries University，2005，34（8）：23-25.（in Chinese）

[4]許春蘭，劉小根，王士長.酶聯(lián)技術(shù)在水產(chǎn)產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物AOZ的檢測的應用[J].食品研究與開發(fā)，2007，3-4：25-27.XU Chun-lai，LIU Xiao-gen，WANG Shi-chang.The application of ELISA for detection AOZ in fishery products[J].Food Research and Development，2007，3-4：25-27.（in Chinese）

[5]李貴賢，李紹白.DMC羰基化合成呋喃唑酮工藝路線的研究[J].石化技術(shù)與應用，2002，20（4）：233-235.LI Gui-xian，LI Shao-bai.Study on process for synthesizing furazolidone by carbonylation of dimethyl carbonate[J].Petrochemical Technology&Application，2002，20（4）：233-235.（in Chinese）

[6]葛寶坤，王云鳳，賀信.高效液相色譜法測定雞肉、水產(chǎn)品中呋喃西林和呋喃唑酮殘留量的研究 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2002，12（6）：661-662.GE Bao-kun，WANG Yun-feng，HE Xin.The method study on determination the pesticide of furacilin and furazolidonum in chicken fish shrimp by the SPE-HPLC[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2002，12 （6）：661-662.（in Chinese）

[7]宋陽威.呋喃類藥物檢驗檢疫現(xiàn)狀及對策[J].中國動物檢疫，2003，20（3）：37.SONG Yan-wei.The status and strategy for quarantine and detection of furacilins[J].China Journal of Animal Quarantine，2003，20（3）：37.（in Chinese）

[8]周立靖，劉志祥.檢測飼料中呋喃唑酮的幾點經(jīng)驗[J].飼料工業(yè)，2003，24（1）：46.ZHOU Li-jing，LIU Zhi-xiang.Several experiments on detection of furazolidone in feeds[J].Feed Industry，2003，24（1）：46.（in Chinese）

[9]于慧娟，蔡友瓊，畢士川，等.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量[J].色譜2005，23（1）：114-115.YU Hui-juan，CAI You-qiong，BI Shi-chuan，et al.Determination of furazolidone residue in aquatic products by high performance liquid chromatography[J].Chinese Journal of Chromatography，2005，23（1）：114-115.（in Chinese）

[10]陳笑梅，鮑曉霞.HPLC法測定鰻魚、豬肉和對蝦中的痢特靈殘留[J].分析測試學報，1994，13（3）：78-80.CHEN Xiao-mei，BAO Xiao-xia.Rapid Determination of furazolidone residue in eel，prawn and pork by HPLC[J].Journal of Instrumental Analysis，1994，13（3）：78-80.（in Chinese）

[11]五慶偉，劉雪英.呋喃唑酮的不良反應及防治[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2000，20（3）：183-184.WU Qing-wei，LIU Xue-ying.Untowad effect and prevention of furazolidone[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2000，20（3）：183-184.（in Chinese）

[12]郭楨，連瑾，吳淑君.動物源性食品中呋喃唑酮及代謝物的檢測[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2005，5：57-59.GUO Zhen，LIAN Jin，WU Shu-jun.Detection of frazolidone and its metabolites in foodstuff originated from animals[J].Guangdong Agricultural Sciences，2005，5：57-59.（in Chinese）

[13]陳兆波.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全分子生物檢測的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J].食品生物技術(shù)學報，2009，28（4）444－450.CHEN Zhao-bo.Molecular detection of the quality and safety of agricultural produces：advances and trends[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（4）444-450.（in Chinese）

[14]Auro A，Sumano H，Ocampo L.Evaluation of the carcinogenic effects off furazolidone and its metabolites in two fish species[J].Journal of Pharmacogenomics，2004，4（1）：24-28.

[15]Alibh.Pharmacological，the rapeutic and toxicological properties of furazolidone：some recent research[J].Veterinary Research Communications，1999，23：343-360.

[16]Mccracken R J，Mccoy M A，Kennedy D G.Furazolidone residues in pigs：criterria to distinguish between treatment and contsmination[J].Food Additives and Contaminants，2000，17（1）：75-82.

[17]Mccracken R J，Spence D E，F(xiàn)loyd S D.Evaluation of the residues offurazolidoneanditsmentabolite，3-amino-2-oxazolidinone（AOZ），in eggs[J].Food Additives and Contaminants，2001，18（11）：954-959.

[18]Keeffe M，Conneely A，Cooper K M，et al.Nitrofuran antibiotic residues in pork[J].Anal Chim Acta，2004，520：125-131.

[19]甘金華，鄧薇，李進平，等.強力霉素人工抗原的合成和抗體的制備[J].食品與生物技術(shù)學報，2011，30（2）：316-320.GAN Jin-hua，DENG Wei，LI Jin-ping，et al.Artificial antigen synthesis and antibody preparation of doxycycline[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（2）：316-320.（in Chinese）

[20]孫海新，凌紅麗，張玉蘭，等.特布他林人工抗原的合成和抗體的制備[J].食品與生物技術(shù)學報，2009，28（3）：371-376.SUN Hai-xin，LING Hong-li，ZHANG Yu-lan，et al.Synthesis of terbutalin artificial antigen and preparation of anti-terbutalin antibody[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（3）：371-376.（in Chinese）