酸性電解水冰理化指標(biāo)變化對(duì)副溶血性弧菌殺菌效果的影響

李繼兵 ， 林 婷 ， 廖 超 ， 靳夢(mèng)曈 ， 潘迎捷 ，2，3， 趙 勇 *，2，3

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海201306）

近年來(lái)，電解水冰逐步成為一種新型的冷殺菌保鮮技術(shù)。該技術(shù)不僅結(jié)合了普通冰的低溫優(yōu)勢(shì)，而且結(jié)合了電解水快速、廣譜殺滅微生物的優(yōu)點(diǎn)[1]。目前，有關(guān)電解水冰的研究主要涉及食品保鮮和微生物殺滅等方面。Feliciano[2]等研究表明，電解水冰可減少魚(yú)片中大腸桿菌和惡臭假單胞菌數(shù)量；Kim[3]研究表明，電解水冰可以顯著阻礙魚(yú)中需氧菌和嗜冷細(xì)菌的生長(zhǎng)；同時(shí)，與普通自來(lái)水冰對(duì)秋刀魚(yú)的保存相比，電解水冰可以延長(zhǎng)大約4～5 d的貨架期；Phuvasate[4]等研究發(fā)現(xiàn)，電解水冰可有效地殺滅大腸桿菌，并可降低貯藏食品物體表面或魚(yú)體表面能夠產(chǎn)生組胺的細(xì)菌；Koseki[5]等研究表明，酸性電解水冰可有效地殺滅和抑制生菜上單增李斯特菌和大腸桿菌。以上研究表明，電解水冰可以有效地殺滅細(xì)菌，并延長(zhǎng)食品的貨架期。因此，探究電解水冰的揮發(fā)動(dòng)力學(xué)，將有助于應(yīng)用電解水冰更好地保障食品的良好品質(zhì)。

許多學(xué)者研究了酸性電解水在不同保存條件下其理化性質(zhì)如pH值、氧化還原電位（ORP）和有效氯含量（ACC）等隨時(shí)間的變化情況[6-9]。然而，對(duì)電解水冰理化指標(biāo)pH、ORP和ACC的系統(tǒng)性研究較少，且對(duì)電解水冰理化指標(biāo)隨時(shí)間的變化及其對(duì)微生物的殺菌效果尚未報(bào)道。

作者主要研究了不同濃度的電解水冰在保存過(guò)程中其主要理化指標(biāo)隨時(shí)間（0、2、4、6、8、10 h）延長(zhǎng)而變化的情況，以及相應(yīng)保存時(shí)間下電解水冰對(duì)副溶血性弧菌的殺滅效果。同時(shí)檢測(cè)酸性電解水冰處理液中微生物殘留情況，為酸性電解水冰推廣應(yīng)用于食品的殺菌和保鮮奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 副溶血性弧菌ATCC33847：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑和設(shè)備 胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）、TCBS培養(yǎng)基：購(gòu)自上海市疾病預(yù)防控制中心；配制0.85%滅菌生理鹽水所用NaCl及NaS2O3、NaH2PO4、Na2HPO4等化學(xué)試劑：均為分析純。FW～200型強(qiáng)AEW生成器（可同時(shí)生產(chǎn)2 L酸性電解水和2 L堿性電解水）：日本AMANO公司；超凈工作臺(tái) ：ESCO WORLD CLASS WORLDWIDE；pH/ORP測(cè)定儀：梅特勒～托利多儀器上海有限公司；RC-3F型高濃度有效氯測(cè)定儀（測(cè)量范圍：0～300 mg/L，分辨率：1 mg/L）：日本；QL-901型漩渦振蕩器：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋：三洋電機(jī)生物醫(yī)藥株式會(huì)社之子公司；移液槍等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸性電解水冰的制備 采用二槽隔膜電解水裝置，通過(guò)調(diào)節(jié)電壓、電流、電解時(shí)間，將不同質(zhì)量濃度 NaCl溶液 （NaCl質(zhì)量濃度為 0.75、1、1.25、1.50、1.75 g/L）電解制得不同濃度酸性電解水（AEW）。制備酸性電解水6 L，置于密封塑料袋內(nèi)、避光保存，于-36℃的冰箱內(nèi)放置24 h，制得酸性電解水冰 （AEW-ice）。

1.2.2 電解水冰的主要理化特性的測(cè)定 將制備后的電解水冰塊敲成碎冰。為了模擬超市食品保存情景，將敲碎的冰放于不銹鋼鐵盒（72 cm×48 cm×9.5 cm）內(nèi)，然后放置在不斷制冷的無(wú)蓋冰箱上。對(duì)制備獲得的各不同濃度酸性電解水冰（AEW-ice）在0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)行隨機(jī)取樣，使其在 60 ℃水浴鍋中立即融化，測(cè)定電解水冰的pH值、ORP和ACC。

1.2.3 菌液的制備及菌懸液的制備 將甘油保藏的副溶血性弧菌ATCC33847接種到9 mL無(wú)菌3%NaCl的胰蛋白酶大豆肉湯中，37℃和180 r/min搖床培養(yǎng)12 h活化，第二次活化接種5管9 mL 3%NaCl的胰蛋白酶大豆肉湯，將活化后獲得的菌懸液在10℃下以 3 000 r/min離心10 min，棄上清液，將沉淀懸浮于20 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，混勻，測(cè)其OD值。最終獲得的菌液含菌量約為9 lg（CFU/mL），備用。

1.2.4 電解水冰處理及增菌試驗(yàn) 不同的時(shí)間點(diǎn)取酸性電解水冰，在無(wú)菌條件下，將1 mL制備的菌懸液分別加入裝有1 mL的酸性電解水冰 （NaCl質(zhì)量濃度為 0.75、1、1.25、1.5、1.75 g/L）融化液的試管中，立即混勻，反應(yīng)時(shí)間為15 s。取0.5 mL以上反應(yīng)液加入到裝有4.5 mL無(wú)菌的中和劑溶液 （含0.5%NaS2O3的PBS緩沖液[10]）試管中，振蕩混勻，以終止反應(yīng)。運(yùn)用0.85%生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，并取100 μL的稀釋液涂布到TCBS瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

為了檢測(cè)酸性電解水冰融化液處理后可能殘存的極少量菌，一方面選擇合適稀釋度涂布于TCBS瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。另一方面需要做增菌試驗(yàn)，即從酸性電解水冰融化液中吸取100 μL加入到10 mL TSB培養(yǎng)基，以180 r/min于37℃搖床培養(yǎng)24 h增菌，結(jié)束后直接涂布于TCBS平板上，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。若計(jì)數(shù)結(jié)果為0，則增菌結(jié)果為陰性；反之，增菌結(jié)果為陽(yáng)性。每個(gè)稀釋度重復(fù)2次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS17.0軟件、OriginPro 8和皮爾森相關(guān)性系數(shù)對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用SPSS17.0軟件中的LSD法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸性電解水冰的主要理化特性

2.1.1 電解水冰保存過(guò)程中pH的變化 在圖1中，隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度電解水冰的pH值均有著明顯的上升趨勢(shì)，這與相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)果相似[8，11]。造成這一現(xiàn)象可能是由于陰離子如Cl-和OCl-吸附在帶正電荷的冰表面，從而導(dǎo)致pH值的增加[3]。0～6 h內(nèi)，不同質(zhì)量濃度間的pH值變化不顯著；而6 h后，NaCl質(zhì)量濃度≤1 g/L制備的電解水冰，其pH變化速率小于NaCl質(zhì)量濃度＞1 g/L。另外由圖1可發(fā)現(xiàn)，NaCl質(zhì)量濃度為0.75、1 g/L制得的電解水冰隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其pH值上升得較為緩慢。NaCl質(zhì)量濃度為1.25、1.5、1.75 g/L制備的電解水冰在0～6 h，其pH值上升也較為緩慢，且其pH在6 h時(shí)仍保持較低的值（pH 2.2）；而在6～10 h時(shí)其pH值上升較快，且pH值上升的幅度從2.2達(dá)到2.9。

圖1 不同保存時(shí)間下電解水冰pH值的變化Fig.1 Changes in pH values of electrolyzed water ice under different storage durations

2.1.2 電解水冰保存過(guò)程中ORP的變化 Kim[12]和Liao[13]等研究表明，ORP是影響微生物失活的主要因素，因?yàn)樗鼤?huì)損壞大腸桿菌的外膜和內(nèi)膜，從而導(dǎo)致大腸桿菌失活。此外，研究表明，好氧性微生物適宜生存的ORP范圍是200～800 mV。因此，探究電解水冰的ORP變化情況，對(duì)于電解水冰用于高效殺滅食源性致病微生物，具有重要意義。圖2顯示，不同質(zhì)量濃度電解水冰的ORP隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均逐漸下降，且ORP變化幾乎全部遵循同一趨勢(shì)；0～6 h這一時(shí)間段內(nèi)，ORP下降較為緩慢，從1 150 mV下降到1 120 mV，下降的幅度范圍為1.91%～4.74%；而6 h后其ORP下降速率明顯快于6 h之前的ORP變化，從1 120 mV下降到1 000 mV，下降的幅度范圍為7.85%～10.9%。

圖2 不同保存時(shí)間電解水冰融化處理后ORP值的變化Fig.2 Changes in ORP values of electrolyzed water ice under different storage durations

2.1.3 電解水冰保存過(guò)程中ACC的變化 Abadias[14]等研究表明，ACC包括次氯酸（HClO）、次氯酸鹽離子（OCl-）和氯（Cl2），是起到殺菌作用的主要因素。因此，探究電解水冰的ACC變化情況，對(duì)于電解水冰用于高效殺滅食源性致病微生物，同樣具有重要意義。圖3中，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，5種電解水冰的ACC均逐漸下降；NaCl質(zhì)量濃度≤1.5 g/L電解水冰的ACC下降速率小于NaCl質(zhì)量濃度＞1.5 g/L。NaCl質(zhì)量濃度為0.75、1、1.25 g/L電解水冰隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其ACC下降較為緩慢，且其ACC下降的幅度從 23 μg/g 到 5 μg/g， 減少了 18 μg/g；NaCl質(zhì)量濃度為1.5、1.75 g/L隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其ACC下降較快，且其ACC下降的幅度從75 μg/g到15 μg/g，減少了60 μg/g。因此，相對(duì)質(zhì)量濃度較高的電解水冰ACC的損失率要大于相對(duì)質(zhì)量濃度較低的電解水冰ACC損失率。

圖3 不同保存時(shí)間電解水冰融化處理后ACC值的變化Fig.3 Changes in ACC values of electrolyzed water ice under different storage durations

2.2 酸性電解水冰對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效果

圖4表明，不同NaCl質(zhì)量濃度的電解水冰在不同保存時(shí)間下對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效果。NaCl質(zhì)量濃度為0.75 g/L電解水冰對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效果在 0～2 h 內(nèi)沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），而其它不同NaCl質(zhì)量濃度的電解水冰在不同時(shí)間下差異均顯著（p＜0.05）。NaCl溶液質(zhì)量濃度為0.75 g/L制備的酸性電解水冰，0 h時(shí)能殺滅菌落數(shù)為2.42 log（CFU/mL），隨著時(shí)間的增加，電解水冰的殺菌能力有較大程度的降低，到第10小時(shí)時(shí)該酸性電解水冰的殺滅菌落數(shù)降低到0.66 lg（CFU/mL），降低了72.9%；質(zhì)量濃度為1.25 g/L的NaCl溶液制成的酸性電解水冰，在0 h時(shí)可殺滅菌落數(shù)3.33 lg（CFU/mL），到第10小時(shí)其殺滅菌落數(shù)為1.37 lg（CFU/mL），降低了58.7%；質(zhì)量濃度為1.5 g/L的NaCl溶液制成的酸性電解水冰，在0 h時(shí)可殺滅菌落數(shù)5.22 lg（CFU/mL），到第10小時(shí)其殺滅菌落數(shù)為2.35 lg（CFU/mL），降低了 54.9%。 以上結(jié)果表明，相對(duì)質(zhì)量濃度較高電解水冰（AEW-ice 4，5）與相對(duì)質(zhì)量濃度較低電解水冰（AEW-ice 1，2，3）相比，在同一環(huán)境條件下保存相同的時(shí)間，其仍具有較強(qiáng)的殺菌能力。

圖4 不同保存時(shí)間電解水冰對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效果Fig.4 Effects of electrolyzed water ice treatments on reducing Vibro.under different storage durations

對(duì)于同一時(shí)間不同質(zhì)量濃度的酸性電解水冰殺菌效果分析可得，除保存0 h下NaCl質(zhì)量濃度為1 g/L和1.25 g/L制備的電解水冰、保存2 h下 NaCl質(zhì)量濃度為1 g/L和1.25 g/L制備的電解水冰以及保存8 h下NaCl質(zhì)量濃度為0.75 g/L和1 g/L制備的電解水冰之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）外，其它時(shí)間相對(duì)應(yīng)的不同質(zhì)量濃度的酸性電解水冰殺菌效果均有顯著性差異（p＜0.05）。不同保存時(shí)間條件下，電解水冰對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效果隨NaCl質(zhì)量濃度的增加而增大。NaCl質(zhì)量濃度為1.75 g/L的電解水冰在保存0 h下具有較強(qiáng)的殺菌能力，其殺菌數(shù)可達(dá)5.75 lg（CFU/mL）。將電解水冰的處理液進(jìn)行涂布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未檢出殘存菌。因此，酸性電解水冰的處理液不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[11，15]也是一致的。

在圖4中，0～10 h處理時(shí)間內(nèi)，相鄰NaCl質(zhì)量濃度為1.5 g/L及1.25 g/L的電解水冰對(duì)副溶血性弧菌的殺菌量差值，與其它所有相鄰濃度間殺菌量差值相比較大，且最高比值可達(dá)117.6倍。結(jié)合電解水冰在保存過(guò)程中其pH值、ORP以及ACC的變化情況，可認(rèn)為在此實(shí)驗(yàn)中，電解水冰較大幅度殺滅副溶血性弧菌的質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)折點(diǎn)是1.5 g/L。

2.3 電解水冰的pH、ORP、ACC與殺菌量的相關(guān)性分析

圖5表示1.5 g/L NaCl電解水冰的 pH、ORP、ACC以及殺菌數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：pH值、ORP和ACC與殺菌數(shù)之間相關(guān)系數(shù)r分別為0.831、0.787和0.944。三個(gè)理化指標(biāo)均影響電解水冰對(duì)副溶血性弧菌的殺菌效果，而ACC對(duì)其殺菌效果的影響最大，與國(guó)內(nèi)外關(guān)于電解水的一些相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果一致[3，16-18]。

圖5 pH、ORP、ACC對(duì)電解水冰殺菌量的皮爾森相關(guān)性系數(shù)Fig.5 Pearson correlation coefficient of pH，ORP，ACC on inactivation of Vibrio Parahaemolyticus

不同的微生物對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性是不同的，但一般來(lái)說(shuō)，微生物生長(zhǎng)過(guò)程中一般要求pH的適應(yīng)范圍為4～9。當(dāng)pH在2.7以下時(shí)，大多數(shù)微生物都是不能生存的。這是因?yàn)槲⑸锏谋砻娼Y(jié)構(gòu)中含有一些兩性物質(zhì)，當(dāng)H+濃度較大時(shí)就會(huì)破壞這些結(jié)構(gòu)成分，使細(xì)胞膜通透性增加，代謝過(guò)程受阻，最終導(dǎo)致死亡。另外，不同微生物其ORP的生存范圍是不同的，好氣性微生物的ORP范圍為200～800 mV，嫌氣性微生物的ORP范圍為-700～1 000 mV。新制備的強(qiáng)酸性電解水冰其ORP值高達(dá)+1 100 mV，可改變細(xì)胞內(nèi)電子流動(dòng)，嚴(yán)重影響微生物的能量代謝與ATP的產(chǎn)生[19]。有效氯包括HClO、ClO-和氯的氧化物。電解質(zhì)溶液中的Cl-在陽(yáng)極被氧化為Cl2后形成HClO，HClO作為殺菌的前提物質(zhì)，具有強(qiáng)氧化性，從而起到殺菌作用。

有關(guān)酸性電解水的主導(dǎo)殺菌因素（pH、ORP、ACC）方面的研究較多，并因此形成了幾個(gè)主流學(xué)說(shuō)，如高氧化還原電位殺菌學(xué)說(shuō)、有效氯殺菌學(xué)說(shuō)等[20]。國(guó)內(nèi)王文清等[21]認(rèn)為，酸性電解水殺菌以化學(xué)殺菌為主，其中有效氯濃度ACC為主要影響因素；以物理殺菌為輔，其中ORP值為主要影響因素；相關(guān)研究也表明，強(qiáng)酸性電解水的殺菌效果主要是其產(chǎn)生的氯氣在起作用[5，22]。隨著微酸性電解水生產(chǎn)裝置的開(kāi)發(fā)和殺菌效果研究的深入，有關(guān)微酸性電解水的主導(dǎo)殺菌因素，目前國(guó)內(nèi)外比較認(rèn)可有效氯中的次氯酸殺菌這一學(xué)說(shuō)。但是對(duì)于酸性電解水的主導(dǎo)殺菌因素，人們更多地認(rèn)為是酸性電解水的各個(gè)殺菌因素（包括 pH、ORP、ACC）協(xié)同作用的結(jié)果[23]。本研究結(jié)果表明，pH、ORP、ACC對(duì)電解水冰的殺菌效果均起到一定的作用。

實(shí)際應(yīng)用中，特別是果品蔬菜貯藏保鮮方面[24]，為了取得更好的殺菌保鮮效果，可獲得較高ACC的電解水冰，但高濃度的ACC可能對(duì)食品感官品質(zhì)產(chǎn)生影響。因此需要在制備過(guò)程中選擇合適的NaCl質(zhì)量濃度進(jìn)行制備。

3 結(jié)語(yǔ)

電解水冰是近年來(lái)發(fā)展的一種新型冷殺菌保鮮技術(shù)。作者對(duì)不同濃度酸性電解水冰的理化指標(biāo)變化與其對(duì)食源性致病菌（副溶血性弧菌）殺滅情況間的關(guān)系進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明：不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液制備的電解水冰在相同貯存時(shí)間內(nèi)，其理化指標(biāo)的變化存在差異，且理化指標(biāo)的變化與殺菌效果間存在一定相關(guān)性，其中ACC對(duì)菌殺滅影響最大，其次分別為pH、ORP。本研究結(jié)果為未來(lái)電解水冰在食品工業(yè)中應(yīng)用于食品保鮮、延長(zhǎng)貨架期及降低食源性致病菌引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)方面提供參考數(shù)據(jù)。

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