血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus SYBC-L7)色素的提取及其理化性質(zhì)

駱守鵬， 范晶晶， 毛飛君， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.金坤生物工程有限公司，江蘇 無錫214131）

隨著生活水平和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，色素逐漸進(jìn)入人們的視野，其不僅廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[1]，同時(shí)還應(yīng)用于醫(yī)藥[2]、化妝品[3]、印染[4]等諸多領(lǐng)域以滿足人們的需求。通常可將色素分為人工合成色素和天然色素兩大類[5]。近年來發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)一部分合成色素存在人體致癌等潛在危害，被禁止使用；相反，天然色素由于其安全可靠，色澤自然鮮艷，且具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥理等功能，倍受人們的青睞，有取代合成色素的趨勢[6]。

天然色素來自于動(dòng)植物材料和微生物，前者由于受到諸多因素，如氣候、季節(jié)等的影響，原料不足，使其應(yīng)用受到局限；而利用微生物資源生產(chǎn)天然色素，不僅能克服前者的諸多缺點(diǎn)，并易于工業(yè)化[7]，逐漸成為天然色素來源的研究熱點(diǎn)。產(chǎn)天然色素的微生物資源十分豐富，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)天然色素的微生物，主要包括原核生物、細(xì)菌、酵母、真菌、淡水藻類等[7]。然而，現(xiàn)階段的產(chǎn)天然色素研究主要集中于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的屈指可數(shù)。

真菌作為微生物資源的一種，由于在其生長代謝過程中會(huì)合成一定的真菌色素[8-9]，近年來備受研究者關(guān)注。根據(jù)色素化合物的基本母核差異，可將真菌色素劃分為醌類、酸類、酮類和含氮化合物4類[6]，如紅曲霉屬發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素（分為紅色和黃色），屬聚酮類化合物[10]，而竹黃菌色素主要是苝醌類化合物[11]，這兩種色素均可用于食品的著色且具有一定的藥理功能。作者利用一株血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus SYBC-L7）采用木屑、稻草秸稈、麥秸稈、水葫蘆和甘蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素，并對(duì)色素的提取條件及理化性質(zhì)進(jìn)行初步研究，探索了該類微生物在資源化利用農(nóng)業(yè)廢棄物的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 血紅密孔菌 （Pycnoporus sanguineus SYBC-L7）為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、丙酮、乙醇、甲醇等試劑：均為國產(chǎn)分析純；木屑：購于當(dāng)?shù)爻校坏静萁斩?、麥秸稈、水葫蘆和甘蔗渣：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）PDA固體培養(yǎng)基 （組分g/L）：去皮土豆200，葡萄糖20，瓊脂20。保藏斜面為PDA固體培養(yǎng)基。

2）種子培養(yǎng)基（組分 g/L）：葡萄糖 30，蛋白胨5，酵母膏 10。

3）固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素培養(yǎng)基：250 mL錐形瓶中加入3 g木屑（或水葫蘆、稻草秸稈、甘蔗渣、麥秸稈），加入4.5 mL營養(yǎng)液。營養(yǎng)液配方（g/L）：葡萄糖30，酒石酸銨 15，硫酸銅 0.04，磷酸二氫鉀 1，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鈉0.2，硫酸錳0.034。種子培養(yǎng)基滅菌條件為115℃滅菌20 min；而其他所有培養(yǎng)基為121℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素 用無菌生理鹽水將P.sanguineus SYBC-L7在30℃下培養(yǎng)7 d的PDA平板洗滌，過濾之后即為孢子液。將孢子液接種到種子培養(yǎng)基（50 mL/250 mL三角瓶），30℃下旋轉(zhuǎn)式搖床200 r/min培養(yǎng)24 h，接種5 mL種子液至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d。發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基于60℃下烘干至恒重并放入干燥器內(nèi)待用。

1.2.2 色素提取條件的研究

1）色素提取溶劑的選擇及測定條件的確定：取發(fā)酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，在20℃、100 r/min的水浴振蕩器中浸泡1 h，過濾并定容至25 mL，進(jìn)行波長掃描，確定所存在的吸收峰。分別選擇甲醇、乙醇、石油醚（30~60℃）、異丙醇、異丁醇，提取色素，在最大吸收波長下檢測提取液吸光值，確定最適提取溶劑。

2）提取溫度對(duì)色素提取的影響：取發(fā)酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，分別置于不同溫度的水浴振蕩器中，100 r/min下浸泡1 h，取出過濾并定容至25 mL，在430 nm處測定吸光值。

3）提取轉(zhuǎn)速對(duì)色素提取的影響：取發(fā)酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，置于35℃水浴振蕩器中，設(shè)定不同的轉(zhuǎn)速，浸泡1 h，取出過濾并定容至25 mL，在430 nm處測定吸光值。

4）提取時(shí)間對(duì)色素提取的影響：取發(fā)酵干基0.2 g，加入20 mL甲醇，置于35℃水浴振蕩器中，分別浸泡 20、40、60、80、100、120 min，過濾并定容至25 mL，在430 nm處測定吸光值。

5）提取料液比對(duì)色素提取的影響：取發(fā)酵干基0.2 g，加入不同體積的甲醇（10、15、20、25、30 mL），并置于35℃水浴振蕩器中，提取40 min，過濾后測定樣品提取液的體積V及其在430 nm處吸光值A(chǔ)，并按照公式（1）計(jì)算總吸光度∑A。

1.2.3 色素的理化性質(zhì)

1）色素的顯色反應(yīng)：對(duì)色素提取液進(jìn)行不同的化學(xué)試劑處理，觀察色素溶液顏色變化。取3 mL色素提取液，分別加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的硝酸鋁、醋酸鉛、氯化鈷、氯化亞鐵、硼酸、氫氧化鈉、氨水，混合放置10 min觀察顏色變化。

2）色素穩(wěn)定性研究

熱穩(wěn)定性：取5 mL色素提取液，分別置于20、30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中加熱 2 h， 冷卻至室溫后測定430 nm處吸光值。

pH穩(wěn)定性：取5 mL色素提取液，用1 mol/L的HCl或 NaOH 調(diào)節(jié)其 pH 值為 1、3、5、7、9、11、13，放置30 min后測定430 nm處吸光值并觀察顏色變化。

氧化劑與還原劑的影響：配制不同濃度梯度的NaHSO3、H2O2、 維生素 C、K2CrO7溶液， 分別取 0.5 mL加入到2.5 mL色素提取液中，放置30 min后測定430 nm處吸光值并觀察顏色變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素及色素的提取

為了探究菌株P(guān).sanguineus SYBC-L7在不同農(nóng)業(yè)廢棄物固態(tài)發(fā)酵時(shí)生長和產(chǎn)色素的情況，選擇稻草秸稈、麥秸稈、水葫蘆、甘蔗渣和木屑5種廢棄物作為固態(tài)基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見表1。

表1 P.sanguineus SYBC-L7在不同基質(zhì)下的生長和產(chǎn)色素情況Table 1 Growth and pigment production by P.sanguineus SYBC-L7 in different solid substrate

實(shí)驗(yàn)中觀察菌株菌絲的生長情況，發(fā)現(xiàn)菌株在水葫蘆和稻草秸稈下，菌株生長緩慢，這可能是因?yàn)樗J和稻草中營養(yǎng)物質(zhì)較少，進(jìn)而影響了菌株的生長。在甘蔗渣中，菌株生長良好但僅有少量色素產(chǎn)生；而在麥秸稈和木屑中菌絲生長較好，均明顯有色素產(chǎn)生，且后者產(chǎn)量高于前者，因此后期將選擇木屑作為發(fā)酵固體的介質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵條件。

菌株 P.sanguineus SYBC-L7在木屑的固態(tài)基質(zhì)下生長較好，且在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物表面有一類橘紅色物質(zhì)產(chǎn)生，見圖1a。將甲醇加入到烘干的固態(tài)培養(yǎng)物中，可較好地提取其中橘紅色色素，所得溶液呈黃色，見圖1b。

圖1 菌株P(guān).sanguineus SYBC-L7在固態(tài)基質(zhì)下產(chǎn)色素及色素甲醇提取液Fig.1 Pigment produced by P.sanguineus SYBC-L7 in solid state fermentation and its methanol extraction solution

圖2為色素提取液的波長掃描圖譜，從圖2可知，發(fā)酵后提取液在可見光區(qū)存在明顯的吸收峰，波長范圍為430~450 nm，該結(jié)果與圖1b結(jié)果相吻合；且其最大吸收波長為430 nm，因此選取430 nm作為后期檢測該色素的波長。

圖2 色素提取液波長掃描圖譜Fig.2 Wavelength scanning of methanol extraction

2.2 色素的提取的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 表2為不同溶劑提取固體發(fā)酵基質(zhì)后的色素提取液在430 nm處吸光值?？芍褂檬兔眩?0~60℃）為提取劑時(shí)吸光值低，表明基本無色素被提取，而異丙醇和異丁醇吸光值較小；甲醇提取液吸光值最大，提取能力最好，乙醇次之，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。

表2 提取溶劑對(duì)色素提取效果的影響Table 2 Effect of different solvents on the extraction of pigment

2.2.2 提取溫度對(duì)色素提取的影響 在不同的溫度下，色素的溶解度有所差異，最終會(huì)影響色素提取效率。圖3為不同溫度下的色素提取結(jié)果，在15~35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，色素吸光值明顯增加，且在35℃達(dá)到最高值，隨后略有所下降。綜合考慮到節(jié)能方面，選擇35℃為最適提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)色素提取的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction of pigment

2.2.3 轉(zhuǎn)速對(duì)色素提取的影響 從圖4可以看出，在不同轉(zhuǎn)速下，色素提取液在430 nm處吸光值差異不顯著，表明轉(zhuǎn)速對(duì)于色素提取影響不大。綜合考慮，提取轉(zhuǎn)速定為50 r/min，以便較好的提取色素。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)色素提取的影響 在色素的提取過程中，提取時(shí)間是一個(gè)很重要的指標(biāo)，縮短提取時(shí)間能提高提取效率。圖5為不同提取時(shí)間色素提取的結(jié)果?？芍?，提取40 min時(shí)提取液吸光值最高，且延長時(shí)間吸光值變化不大，表明在40min時(shí)候能夠較好的提取色素，因此選40min為最適提取時(shí)間。

圖4 提取轉(zhuǎn)速對(duì)色素提取的影響Fig.4 Effect of rotating speed on the extraction of pigment

圖5 提取時(shí)間對(duì)色素提取的影響Fig.5 Effect of time on the extraction of pigment

2.2.5 料液比對(duì)色素提取的影響 圖6為不同料液比對(duì)色素提取液總吸光值∑A的結(jié)果，在0.2：10時(shí)色素總吸光值較低，而在0.2：15時(shí)較高；而繼續(xù)減小料液比時(shí)，色素總吸光值變化不明顯，因此選擇0.2∶15的料液比進(jìn)行色素提取。

圖6 料液比對(duì)色素提取的影響Fig.6 Effect of material to liquid ratio on the extraction of pigment

2.3 色素的理化性質(zhì)

2.3.1 色素提取液的顯色反應(yīng) 由于多數(shù)天然產(chǎn)物含有特殊基團(tuán)，能夠在不同的處理溶液條件下呈現(xiàn)特定的反應(yīng)變化[12]。由表3可知，醋酸鉛溶液處理會(huì)產(chǎn)生黃色沉淀，而其他處理均無沉淀產(chǎn)生，可能是由于色素化合物含有羥基和羰基結(jié)構(gòu)，能與醋酸鉛形成絡(luò)合物；氫氧化鈉和氨水處理后，提取液顏色變成淺土色，可能是由于溶液的pH值呈堿性導(dǎo)致。

表3 化合物處理對(duì)色素顏色的影響Table 3 Effect of chemical compound on the pigment

2.3.2 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 從圖7可知，在20~60℃范圍內(nèi)，吸光值無明顯變化，表明該色素在所選擇的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，具有較強(qiáng)的耐熱性。

圖7 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on stability of pigment

2.3.3 pH對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 pH值對(duì)天然色素的影響主要是使天然色素的結(jié)構(gòu)或組成發(fā)生變化，從而使其顏色產(chǎn)生變化[13]。色素提取液的pH穩(wěn)定性結(jié)果見表4。由表4可知，色素在酸性條件下較為穩(wěn)定，呈黃色；而當(dāng)pH為堿性時(shí)，色素吸光值降低，且顏色逐漸變淺，呈黃灰色。

2.3.4 氧化劑與還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響 由圖8可知，加入不同濃度的NaHSO3、H2O2溶液的吸光度沒有明顯的變化，且溶液顏色基本無變化；而加入VC之后，溶液的吸光值有所下降，且溶液的顏色逐漸變淺，可能是因?yàn)樯啬芘cVC發(fā)生某種反應(yīng)，從而導(dǎo)致溶液顏色變淺且吸光值下降。但K2CrO7加入之后，溶液迅速變色且出現(xiàn)紅色沉淀，這可能是因K2CrO7氧化性太強(qiáng)，色素直接被氧化形成沉淀。

表4 pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of pH on stability of pigment

圖8 氧化劑與還原劑的濃度對(duì)色素的影響Fig.8 Effect of oxidizer and reducing agents on pigment stability

3 結(jié)語

通過微生物發(fā)酵技術(shù)，可將農(nóng)業(yè)固體廢棄物作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料，在合理處置農(nóng)業(yè)固體廢棄物的同時(shí)，也可產(chǎn)生一些高附加值的生物活性物質(zhì)如生物酶、天然色素等。血紅密孔菌是自然界中廣泛存在的一類白腐真菌，其在生長過程中會(huì)產(chǎn)生一類紅色的色素，有報(bào)道稱血紅密孔菌的色素具有一定的抑制細(xì)菌生長的作用[14]，可作為功能性的天然色素使用，因此研究這類真菌發(fā)酵產(chǎn)色素的條件及色素的提取條件和色素的理化性質(zhì)具有一定的理論和應(yīng)用價(jià)值。

作者研究了血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L7固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素的條件，發(fā)現(xiàn)菌株在木屑固態(tài)培養(yǎng)下菌株產(chǎn)色素較好。在35℃水浴條件下，使用甲醇浸泡40 min可較好的提取固體發(fā)酵后的色素；同時(shí)，該色素具有較好的熱穩(wěn)定性和耐酸性，常用的氧化劑與還原劑對(duì)其影響不大，初步認(rèn)定其為一種穩(wěn)定性較好的天然色素。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)研究色素的分離純化條件，確定色素的組成成分、分子組成、分子結(jié)構(gòu)等，以進(jìn)一步了解血紅密孔菌色素的性質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

[1]成黎.天然食用色素的特性、應(yīng)用、安全性評(píng)價(jià)及安全控制[J].食品科學(xué)，2012，33（23）：399-404.CHENG Li.Characteristics，application，safety evaluation and safety control of natural food pigments[J].Food Science，2012，33（23）：399-404.（in Chinese）

[2]楊新河，呂幫玉，毛清黎，等.茶色素的生物活性研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（1）：102-105.YANG Xin-he，LU Bang-yu，MAO Qing-li，et al.Research progress in biological activity of tea pigments[J].Acta Agriculturae Jiangxi，2012，24（1）：102-105.（in Chinese）

[3]侯擁铓，王建華.天然色素的開發(fā)應(yīng)用[J].中國藥業(yè)，2009，18（7）：1-4.HOU Yong-mang，WANG Jian-hua.Exploitation and application of natural pigment[J].China Pharmaceuticals，2009，18（7）：1-4.（in Chinese）

[4]沈國強(qiáng)，楊春霞，張棟.天然色素（染料）的研究及發(fā)展趨勢[J].染料與染色，2009，46（1）：7-10.SHEN Guo-qiang，YANG Chun-xia，ZHANG Dong.Research and development of nature colorant （Dyestuff）[J].Dyestuffs and Coloration，2009，46（1）：7-10.（in Chinese）

[5]李昌偉，蔡宇杰，廖祥儒，等.鐮刀霉菌（Fusarium sp）JN158紫色素的提取及理化性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：0138-0144.LI Chang-wei，CAI Yu-jie，LIAO Xiang-ru，et al.Study on extraction and the physicochemical property of purple pigment from Fusarium sp.JN158[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（1）：138-144.（in Chinese）

[6]昝立峰，圖力古爾.大型真菌色素的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景[J].菌物研究，2005，3（4）：57.ZAN Li-feng，BAU Tolgor.Present situations of researches on macrofungal pigments and their application prospects[J].Journal of Fungal Research，2005，3（4）：57-62.（in Chinese）

[7]王君，張寶善.微生物生產(chǎn)天然色素的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2007，34（3）：580-584.WANG Jun，ZHANG Bao-shan.Research progress on natural pigments produced by microorganism[J].Microbiology China，2007，34（3）：580-584.（in Chinese）

[8]Jan Velísek K C.Pigments of higher fungi：A review[J].Czech Journal Food Sciences，2011，29（2）：87.

[9]Gill M.Pigments of fungi（Macromycete）[J].Natural Products Report，2003，20（615-639）：615.

[10]王金字，董文賓，楊春紅，等.紅曲色素的研究及應(yīng)用新進(jìn)展[J].食品科技，2010，35（1）：245-248.WANG Jin-zi，DONG Wen-bin，YANG Chun-hong，et al.The new research and application progress of Monascus pigments[J].Food Science and Technology，2010，35（1）：245-248.（in Chinese）

[11]韓錢松，沈健增，蔡宇杰，等.維生素對(duì)竹黃菌發(fā)酵產(chǎn)苝醌類色素的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32（2）：119-123.HAN Qian-song，SHEN Jian-zeng，CAI Yu-jie，et al.Effect of vitamins on perylenequinones production of Shiraia bambusicola[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（2）：119-123.（in Chinese）

[12]張培成.黃酮化學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：350-400.

[13]植中強(qiáng)，李紅纓，楊海貴.天然食用色素提取工藝與穩(wěn)定性研究的狀況[J].廣州化工，1999，27（4）：18-20.ZHI Zhong-qiang，LI Hong-ying，YANG Hai-gui.Research progress on extraction and stability of natural food pigments[J].Guangzhou Chemical Industry，1999，27（4）：18-20.（in Chinese）

[14]A Smania F D M，E F A Smania，M L Gil，et al.Antibacterial activity of a substance produced by the fungus Pycnoporus sanguineus（Fr.）Murr.[J].Journal of Ethnopharmacology，1995，45（3）：177-181.