對(duì)羥基聯(lián)苯比色法測(cè)定乳酸顯色反應(yīng)條件的研究

萬楚筠，鈕琰星，黃鳳洪，* ，胡雙喜

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北武漢430062;2.油料脂質(zhì)化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430062)

乳酸(Lactic acid，分子式C3H6O3)，作為一種含有羥基和羧基的有機(jī)酸，廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中［1］，是三大有機(jī)酸之一。乳酸即是生物體無氧糖代謝的重要產(chǎn)物，也是一種重要的食品添加劑，在食品、醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)、皮革、香料等領(lǐng)域用途廣泛［2］，因而成為國(guó)內(nèi)外研究者重點(diǎn)研究的對(duì)象。為此，建立一套穩(wěn)定、準(zhǔn)確和成本較低的乳酸定量測(cè)試方法成為順利開展乳酸研究的關(guān)鍵。現(xiàn)在已經(jīng)建立起來的乳酸測(cè)定方法主要有:容量法［3-4］，分光光度法［5-6］和色譜分離法［7-8］。容量法對(duì)乳酸測(cè)試的特異性低，易受干擾，準(zhǔn)確度不高，但操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低;紫外分光-酶法雖然快速準(zhǔn)確，但需要用到的乳酸脫氫酶價(jià)格較貴，不易獲得，實(shí)驗(yàn)操作要求及費(fèi)用較高;可見光比色法采用對(duì)羥基聯(lián)苯顯色，對(duì)于乳酸檢測(cè)特異性較好、靈敏度高，不需要特殊試劑，準(zhǔn)確性較高、測(cè)試成本低，但操作略顯繁瑣。色譜法精確度較高，但設(shè)備昂貴，需要對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行嚴(yán)格的前處理，對(duì)操作人員要求較高;因此，在缺少一些較昂貴的設(shè)備時(shí)，采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法測(cè)乳酸成為廣大食品企業(yè)的經(jīng)濟(jì)之選。目前有關(guān)對(duì)羥基聯(lián)苯比色法測(cè)乳酸的文獻(xiàn)報(bào)道中［5，9-12］，研究者所述的顯色條件、步驟和現(xiàn)象等都存在較大差異，對(duì)于顯色后溶液的最大吸收波長(zhǎng)、沸水浴時(shí)間、顯色劑濃度和用量均有不同說法，迄今為止還未見對(duì)該方法的顯色條件進(jìn)行系統(tǒng)研究的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在綜合前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)比色法測(cè)乳酸的顯色條件進(jìn)行系統(tǒng)的分析和探討，以期為食品中乳酸的測(cè)定研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乳酸鋰、對(duì)羥基聯(lián)苯、五水硫酸銅、濃硫酸(95%～98%，密度為1.84g/cm3)、氫氧化鈣 均為分析純;4%硫酸銅溶液(w/v)稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O)4g，加蒸餾水約70mL，加熱使溶解，再用蒸餾水稀釋至100mL;稱取對(duì)羥基聯(lián)苯1.5g溶于0.125mol/L氫氧化鈉100mL中(稍稍加溫助溶，最好不要超過80℃)，貯于棕色瓶試劑中，保存于4℃冰箱內(nèi)，可使用一個(gè)月;乳酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(1mg/mL)精確稱取無水乳酸鋰106.5mg，溶于50mL蒸餾水中，加0.5mol/L硫酸20mL，再加蒸餾水稀釋至100mL，混勻后保存于4℃冰箱;乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(200μg/mL)使用時(shí)取儲(chǔ)存液5mL用蒸餾水稀釋至25mL，在4℃冰箱中，可保存數(shù)天。

紫外可見光分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、電子分析天平、電爐。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

吸取待測(cè)樣液0.5mL在各比色管中，再加入少許4%硫酸銅溶液，混勻后將預(yù)冷的濃硫酸緩慢加入各管中，搖勻后置于沸水浴中加熱5min，取出后迅速置于冰水浴中冷卻至20℃以下。然后在各管中緩慢加入1mL蒸餾水和1.5%對(duì)羥基聯(lián)苯溶液少許，充分振搖后，水浴保溫一段時(shí)間進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色完成后，再將各管置于沸水浴中加熱90s后，立即放入冰水浴中冷卻至室溫后測(cè)其最大吸光值。

1.2.1 濃硫酸加入量的影響 吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液2.5mL加入蒸餾水7.5mL配成乳酸濃度為50μg/mL的待測(cè)液。按方法1.2所述的步驟進(jìn)行操作，操作條件分別是:4%硫酸銅溶液0.05mL，加入各管的硫酸量分別為 4、5、6、7、8mL，沸水浴時(shí)間為 5min，1.5%對(duì)羥基聯(lián)苯溶液為0.05mL，顯色水浴溫度為30℃時(shí)間為15min，顯色后沸水浴加熱時(shí)間為90s，操作完成后，用分光光度計(jì)掃描各管的最大吸收波長(zhǎng)和吸光值。

1.2.2 加入顯色劑后保溫靜置時(shí)間和溫度的影響其它條件如1.2.1所示，加入各管的硫酸量為6mL，顯色水浴溫度為30、40、50、60℃時(shí)，保溫時(shí)間分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40min。

1.2.3 對(duì)羥基聯(lián)苯添加量的影響 其它條件如1.2.2所示，1.5%對(duì)羥基聯(lián)苯溶液為 0.02、0.05、0.08、0.11、0.14mL，改變補(bǔ)加水量使顯色劑與蒸餾水的總體積仍為 1.05mL，顯色水浴溫度為 50℃，保溫時(shí)間為15min。

1.2.4 加入顯色劑后沸水浴時(shí)間的影響 其它條件如1.2.3所示，1.5%對(duì)羥基聯(lián)苯溶液為0.05mL，顯色后沸水浴時(shí)間分別為 75、90、105、120、135s。

1.2.5 乳酸與濃硫酸共熱時(shí)間的影響 其它條件如1.2.4所示，加入濃硫酸后沸水浴時(shí)間分別為3、4、5、6、7min，顯色后沸水浴時(shí)間為90s。

1.2.6 顯色物質(zhì)的穩(wěn)定性 按上述條件顯色后的溶液，在其最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)其在室溫下放置0、30、60、90、120、150min 時(shí)的吸光值。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制不同乳酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液后，吸取標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液0.5mL按上述步驟顯色，測(cè)其吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 濃硫酸加入量的影響

濃硫酸加入量對(duì)顯色反應(yīng)的影響如圖1所示，從圖中可以看出隨著濃硫酸添加量的增加，顯色液的最大吸光值也隨之增大，同時(shí)最大吸收波長(zhǎng)也逐漸變小，從578nm變動(dòng)到567nm。這說明濃硫酸的相對(duì)濃度對(duì)顯色反應(yīng)具有顯著的影響。

圖1 不同濃硫酸加入量時(shí)顯色后溶液最大吸收波長(zhǎng)掃描Fig.1 The maximum absorption wavelength scanning of chromogenic solution obtained by using different concentrations sulfuric acid

根據(jù)比色法測(cè)乳酸的原理可知，濃硫酸在測(cè)試過程主要有以下幾種作用:一是在加熱條件下將乳酸分解為乙醛和甲酸，而甲酸不穩(wěn)定在濃硫酸的作用下發(fā)生脫水反應(yīng)生成一氧化碳和水;二是乙醛和對(duì)羥基聯(lián)苯反應(yīng)，在濃硫酸的作用下可能在對(duì)羥基聯(lián)苯OH基團(tuán)的鄰位上發(fā)生縮合，而形成二對(duì)羥基聯(lián)苯基乙烷;在濃硫酸溶液中二對(duì)羥基聯(lián)苯基乙烷會(huì)緩緩地氧化成未知結(jié)構(gòu)的紫色產(chǎn)物。在整個(gè)反應(yīng)體系中濃硫酸主要起縮合劑和氧化劑的作用。在顯色過程中，也觀察到，反應(yīng)溶液的顏色先是由無色變?yōu)樗{(lán)色，然后在靜置的過程中漸漸變紫，濃硫酸加入量不同最后變紫的程度也不同。由此可以推斷，當(dāng)濃硫酸的相對(duì)濃度變化時(shí)，其縮合和氧化能力隨之改變，導(dǎo)致反應(yīng)生成發(fā)色體的質(zhì)和量也有所改變，從而引起吸光值和最大吸收波長(zhǎng)的變動(dòng)。

2.2 加入顯色劑后保溫靜置時(shí)間和溫度的影響

顯色反應(yīng)完成需要一定的溫度和時(shí)間，由圖2可知，當(dāng)水浴溫度為30℃時(shí)，隨著保溫時(shí)間的增加，反應(yīng)溶液的吸光值也迅速增加，但是保溫時(shí)間超過30min時(shí)，溶液吸光值幾乎保持不變，其最大吸光值為1.1652;當(dāng)水浴溫度為40℃時(shí)，溶液吸光值的變化趨勢(shì)與30℃時(shí)類似，只是在保溫時(shí)間為25min時(shí)，溶液吸光值就不再變化，最大吸光值比30℃時(shí)降低了7.94%;當(dāng)水浴溫度為50℃時(shí)，保溫時(shí)間達(dá)到10min時(shí)，溶液吸光值就趨于穩(wěn)定，隨著保溫時(shí)間的增長(zhǎng)，吸光值增加非常緩慢，最大吸光值只有30℃時(shí)的72.5%，降低明顯;水浴溫度達(dá)到60℃時(shí)，保溫時(shí)間在5～40min變化時(shí)，溶液吸光值比較穩(wěn)定，總體呈緩慢減小的趨勢(shì)。

圖2 保溫靜置時(shí)間和溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of water bath time and temperature on the chromogenic reaction

有研究表明［13］，對(duì)羥基聯(lián)苯在35℃以上時(shí)，易被濃硫酸氧化破壞，從而引起顏色損失。從圖2可以明顯看出，在水浴溫度為50℃時(shí)，加熱10min對(duì)羥基聯(lián)苯就基本被破壞，從而使吸光值不再變化;當(dāng)水浴溫度達(dá)到60℃，對(duì)羥基聯(lián)苯被迅速氧化，使反應(yīng)溶液吸光值顯著降低。

2.3 對(duì)羥基聯(lián)苯添加量的影響

對(duì)羥基聯(lián)苯添加量對(duì)顯色反應(yīng)的影響見圖3所示。從圖3可以看出，顯色后溶液吸光值隨著對(duì)羥基聯(lián)苯添加量的增加而升高，當(dāng)添加1.5%的對(duì)羥基聯(lián)苯溶液達(dá)到0.11mL時(shí)，溶液吸光值達(dá)到最大，之后再增加對(duì)羥基聯(lián)苯的量，溶液吸光值無明顯變化。

圖3 對(duì)羥基聯(lián)苯添加量對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of p-hydroxydiphenyl dosage on the chromogenic reaction

2.4 加入顯色劑后沸水浴時(shí)間的影響

在加入顯色劑后，由于對(duì)羥基聯(lián)苯不溶于強(qiáng)酸，在溶液中呈白色絮狀懸浮，隨著顯色反應(yīng)的進(jìn)行，懸浮物逐漸減少，反應(yīng)溶液的顏色也由無色變?yōu)樗{(lán)色，當(dāng)顯色過程結(jié)束后溶液略顯紫色，將反應(yīng)溶液置于沸水中加熱超過1min時(shí)，溶液的顏色變得更紫，也更澄清透明。由圖4可以看出，反應(yīng)溶液吸光值隨著沸水浴時(shí)間的增加略有降低，在沸水浴90s之后吸光值趨于穩(wěn)定。

對(duì)顯色溶液沸水浴一定時(shí)間，目的是通過破壞顯色劑使溶液變得更澄清，并且使溶液的顏色變得更穩(wěn)定。也有研究表明［13］:顯色后沸水浴時(shí)間在1～2min之間變動(dòng)時(shí)，對(duì)結(jié)果沒有影響，但長(zhǎng)時(shí)間的加熱會(huì)影響顏色的光譜屬性。

圖4 顯色后沸水浴時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of the boiling water bath time on the chromogenic reaction

2.5 乳酸與濃硫酸共熱時(shí)間的影響

濃硫酸可將乳酸氧化分解為乙醛，這個(gè)反應(yīng)需要在加熱的條件下才能發(fā)生。由圖5可知，濃硫酸與乳酸在加熱4min后就可將乳酸完全轉(zhuǎn)化為乙醛，溶液吸光值達(dá)到最大，之后繼續(xù)加熱溶液吸光值變化不大。實(shí)際操作過程中為了確保乳酸與濃硫酸能充分反應(yīng)，適當(dāng)延長(zhǎng)沸水浴時(shí)間是必要的，因此在進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)取沸水浴時(shí)間5min較為合適。

圖5 濃硫酸與乳酸共熱時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of the time to heat the concentrated sulfuric acid and lactic acid on the chromogenic reaction

2.6 顯色物質(zhì)的穩(wěn)定性

乳酸與濃硫酸在加熱條件下生成的乙醛與對(duì)羥基聯(lián)苯反應(yīng)，在對(duì)羥基聯(lián)苯OH基團(tuán)的鄰位上發(fā)生縮合，而形成二對(duì)羥基聯(lián)苯基乙烷在濃硫酸溶液中二對(duì)羥基聯(lián)苯基乙烷會(huì)緩緩地氧化成未知結(jié)構(gòu)的紫色產(chǎn)物。從圖6可以看出，當(dāng)加熱完成后，該紫色產(chǎn)物的顏色非常穩(wěn)定，其在570nm處有最大吸收峰，初始吸光值為0.8254，在室溫放置150min后，其吸光值為0.8284，變化非常小。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)上述研究，選擇加入待測(cè)樣品量0.5mL，4%硫酸銅溶液加入量0.05mL，濃硫酸加入量6mL，濃硫酸與乳酸沸水浴時(shí)間5min，1.5%對(duì)羥基聯(lián)苯添加量0.11mL，在30℃下水浴顯色30min后再沸水浴90s為反應(yīng)條件，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液乳酸濃度在0～50μg/mL之間變化時(shí)的吸光值，繪制曲線如圖7所示。

從圖7可以看出，在上述反應(yīng)條件下，乳酸濃度在0～15μg/mL范圍內(nèi)與吸光值基本呈線性關(guān)系(R2=0.997)，當(dāng)乳酸濃度大于20μg/mL溶液吸光值與線性偏差逐漸變大。

圖6 顯色完成后溶液放置時(shí)間對(duì)吸光值的影響Fig.6 Effect of the standing time after chromogenic reaction completion on absorbance values

圖7 乳酸濃度與吸光值之間的關(guān)系Fig.7 The relationship between lactic acid concentration and absorbance values

3 結(jié)論

對(duì)采用對(duì)羥基聯(lián)苯為顯色劑測(cè)定乳酸的反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明濃硫酸對(duì)顯色反應(yīng)有重要影響，當(dāng)濃硫酸的相對(duì)濃度發(fā)生變化時(shí)，顯色體系的最大吸收波長(zhǎng)和吸光值也相應(yīng)改變，因此在濃硫酸添加量或是樣品量相對(duì)值發(fā)生變化時(shí)要重新掃描反應(yīng)體系的最大吸收波長(zhǎng)，以獲得最佳靈敏度。顯色水浴保溫時(shí)間和溫度對(duì)測(cè)定方法的靈敏度也有較大影響，在其它條件不變的情況下，水浴溫度為30℃時(shí)，保溫30min可以獲得最大吸光值;當(dāng)顯色水浴溫度達(dá)到60℃，對(duì)羥基聯(lián)苯被迅速氧化，使反應(yīng)溶液吸光值顯著降低，因此在顯色過程中要嚴(yán)格控制顯色反應(yīng)體系的溫度。選擇加入待測(cè)樣品量0.5mL，4%硫酸銅溶液加入量0.05mL，濃硫酸加入量6mL，濃硫酸與乳酸沸水浴時(shí)間5min，1.5%對(duì)羥基聯(lián)苯添加量0.11mL，在30℃下水浴顯色30min后再沸水浴90s為反應(yīng)條件進(jìn)行顯色，結(jié)果表明乳酸濃度在0～15μg/mL范圍內(nèi)與吸光值基本呈線性關(guān)系(R2=0.997)。

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