滑子菇多糖超聲輔助提取工藝及抗氧化活性評(píng)價(jià)

賀 婷，向 瑩，陳 健

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

滑子菇(Pholiota nameko)又名珍珠菇、真姬菇，屬于擔(dān)子菌綱，原產(chǎn)于日本，自七十年代中葉，始于遼寧省南部地區(qū)，現(xiàn)主產(chǎn)區(qū)為河北北部、遼寧、黑龍江等地?；庸骄w淡黃色到黃褐色，邊緣略淡，由于子實(shí)體表面附有粘液，手摸粘滑，故以滑子菇得名。多糖是滑子菇重要的活性成分，具有增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤等生物活性［1］。最常用提取多糖的方法是熱水浸提法［2］，但是這種提取方法具有時(shí)間長(zhǎng)、溫度高等缺點(diǎn)。超聲能夠加速細(xì)胞的破碎，傳質(zhì)強(qiáng)化，促進(jìn)滲透和毛細(xì)血管效應(yīng)［3］，因此可以加快多糖的提取和生物活性物質(zhì)的提?。?-6］。本文采用超聲波提取和熱水浸提法結(jié)合的方式進(jìn)行提取多糖即超聲輔助提取。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化多糖最佳提取工藝，并采用對(duì)DPPH·、·和OH·的清除能力以及還原能力實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滑子菇 廣州一德路干貨市場(chǎng);二苯基苦味?；诫?DPPH)Sigma公司;無(wú)水乙醇、丙酮、H2O2、FeSO4·7H2O、水楊酸、鐵氰化鉀、FeCl3、KBr、葡萄糖、苯酚和濃硫酸等試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KDC-40低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV-5200型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司生產(chǎn);Vector 33型傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruck公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滑子菇多糖的提取工藝 滑子菇→粉碎→60目篩→超聲波處理→恒溫水浴提取→離心→過(guò)濾→濃縮→烘干得滑子菇多糖(粗品)

1.2.2 多糖含量與提取率的測(cè)定 苯酚-硫酸法［7］。

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取在105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品2g，定容于1000mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為2g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，分別加入蒸餾水補(bǔ)足到1mL，然后再分別加入6%的苯酚1mL和濃硫酸5mL，充分搖勻后冷卻。以不加樣品作為空白對(duì)照，在490nm處分別測(cè)量吸光值，以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:y=1.1991x-0.0014，R2=0.9994。

1.2.2.2 樣品含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取滑子菇多糖(PNP)10mg，定容于50mL容量瓶中，吸取0.4mL樣品溶液，再依次加入苯酚溶液和濃硫酸，振蕩搖勻，冷卻后在490nm處測(cè)吸光度，計(jì)算樣品溶液多糖的含量。

1.2.2.3 樣品多糖得率的計(jì)算 多糖得率(%)=糖濃度×體積×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量×100。

1.2.3 影響多糖得率的因素

1.2.3.1 超聲波頻率對(duì)多糖得率的影響 稱2g滑子菇粉末5份，按1∶20的料液比加入40mL蒸餾水，分別依次考察在40、60、70、80、100Hz 超聲頻率下超聲10min，然后在80℃下水浸提2h，測(cè)定多糖得率，求取平均值。

1.2.3.2 超聲波振蕩時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 稱2g滑子菇粉末5份，按1∶20的料液比加入40mL蒸餾水，在80Hz超聲頻率下分別超聲 5、10、15、20、25min后，在80℃下水浸提2h，測(cè)定多糖得率，求取平均值。

1.2.3.3 液料比對(duì)多糖得率的影響 稱2g滑子菇粉末 5 份，按 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 的液料比分別加入20、30、40、50、60mL 蒸餾水，在 80Hz超聲頻率下超聲10min，然后在80℃下水浸提2h，測(cè)定多糖得率，求取平均值。

1.2.4 多糖提取工藝的優(yōu)化 采用正交實(shí)驗(yàn)法:選用超聲頻率(A)、超聲時(shí)間(B)、料液比(C)三個(gè)因素，每個(gè)因素三個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal test

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 清除DPPH自由基的測(cè)定［8-9］取樣品不同濃度提取液0.6mL，分別加入0.1mmol/L DPPH溶液2.0mL，混勻在25℃下密閉靜置25min，用蒸餾水作參比，于517nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。根據(jù)公式計(jì)算不同濃度提取液對(duì)DPPH自由基的清除率:

式中，A1為加提取液后DPPH溶液的吸光度;A0為未加提取液時(shí)DPPH溶液的吸光度。

1.2.5.2 清除O-2·的測(cè)定 50mmol/L Tris-HCl緩沖液1.84mL，加入0.4mL的樣品和0.16mL鄰苯三酚溶液，搖勻，4min后加 8mmol/L的 HCl終止劑0.4mL。在325nm下立即測(cè)定吸光度。根據(jù)公式計(jì)算多糖對(duì)·的抑制率:

式中，A1為加提取液的吸光度;A0為未加提取液時(shí)吸光度。

1.2.5.3 清除·OH的測(cè)定 參考Nicholas＆Quinton［10］并做修改，試管中依次加入 1mL FeSO4(9mmol/L)與1mL不同濃度提取液樣品和1mL水楊酸(9mmol/L)混勻后，37℃水浴靜置10min，加入6mmol/L H2O21mL，37℃ 水浴靜置 30min后，在510nm測(cè)定吸光度A1;不加提取液樣品，以去離子水補(bǔ)足，同上操作處理，測(cè)定其對(duì)比吸光度A0;用去離子水為參比。根據(jù)公式計(jì)算每種提取液對(duì)·OH的清除率:

1.2.5.4 還原能力測(cè)定［11］在0.6mL pH6.6磷酸緩沖溶液(200mmol/L)中加入0.6mL提取物溶液，2.5mL 1%鐵氰化鉀，混合物在 50℃恒溫，保溫20min，急速冷卻，加0.6mL 10% 三氯乙酸，離心分離10min。取上層清液1mL，加入1mL水，再加入0.2mL 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10min后在波長(zhǎng)700nm下測(cè)吸光值，值越大，則樣品的還原力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 超聲波頻率的影響 在超聲時(shí)間為10min時(shí)，液料比為20∶1，分別采用不同的超聲頻率40、60、70、80、100Hz進(jìn)行輔助提取。測(cè)定滑子菇多糖的得率，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著超聲頻率的增大，多糖得率逐漸增多。其原因可能是隨頻率的增加，產(chǎn)生的沖擊力、剪切力也增大，使多糖溶出率增加。當(dāng)頻率為80Hz時(shí)，多糖的得率上升幅度趨于平緩。超聲頻率越大，超聲波與媒質(zhì)相互作用的熱學(xué)機(jī)制和空化機(jī)制［12-13］使得多糖分子會(huì)發(fā)生分解。因此，選用80Hz為最佳頻率。

圖1 超聲頻率對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic rate on polysaccharide yield

2.1.2 超聲時(shí)間的影響 在超聲頻率為80Hz，液料比為 20∶1，分別采用不同超聲時(shí)間 5、10、15、20、25min進(jìn)行輔助提取。從圖2中可以看出隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，滑子菇多糖的得率先升后降;在前10min多糖的得率隨時(shí)間增加上升較快，這是由于隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞破碎度加大，內(nèi)部的多糖物質(zhì)開始溶出，得率升高;在10～25min之間，隨時(shí)間的增加下降幅度較小，其原因可能是超聲時(shí)間延長(zhǎng)，超聲過(guò)程中不斷產(chǎn)生熱量使糖降解［14］。因此，選擇超聲時(shí)間10min為最佳。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasound treatment time on polysaccharide yield

2.1.3 液料比的影響 在超聲時(shí)間10min，頻率為80Hz下，改變蒸餾水體積與滑子菇粉末質(zhì)量的比，考察不同液料比對(duì)多糖得率的影響。由圖3可以看出，隨著液料比的增大，多糖的得率增大。但當(dāng)液料比大于20∶1后，多糖得率下降。這可能是過(guò)多的提取劑破壞滑子菇細(xì)胞，使細(xì)胞膜受到損害，造成細(xì)胞液或其他成分溶出，導(dǎo)致多糖得率下降。所以，液料比選擇 20∶1。

圖3 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid/material ratio on polysaccharide yield

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)，得出不同超聲頻率(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)組合提取滑子菇多糖得率如表2所示。

由表2分析表明，以水為溶劑超聲輔助提取滑子菇多糖，最佳搭配組合為 A3B2C1，即超聲頻率為80Hz、超聲時(shí)間 15min、液料比為 15∶1，多糖得率為10.791%;其次是A3B3C2，多糖得率為9.912%。從表2中K1、K2和K3可以看出，在各因子的水平中，分別以 A3(80Hz)、B2(15min)、C2(20∶1)為最佳水平，按該水平即A3B2C2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果多糖得率為11.219%，高于組合A3B2C1，因此，超聲輔助提取滑子菇多糖的最佳提取工藝條件為A3B2C2，，即為以液料比為 20∶1，在 80Hz 下，超聲15min。

表2 超聲輔助提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment of ultrasonic synergistic extraction and results

由表3方差分析表表明，超聲頻率為主要因子，其不同水平對(duì)滑子菇多糖的提取影響最大;其次是超聲時(shí)間，為次要因子;而液料比的影響最小。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.3 抗氧化活性

從圖7可以看出，隨著粗多糖濃度的增加，多糖的還原能力逐漸增強(qiáng)。還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，提供可阻斷Fe2+向Fe3+轉(zhuǎn)變的電子;多糖的分子鏈中活性的羥基提供電子或氫原子的能力強(qiáng)，與自由基充分作用，表現(xiàn)出抗氧化活性［17］。VC濃度在0.8mg/mL時(shí)，還原能力可與PNP濃度在10mg/mL相比。

圖4 不同濃度多糖對(duì)DPPH·的清除活性Fig.4 DPPH·scavenging capability of different polysaccharide

圖5 不同濃度多糖對(duì)·OH的清除活性Fig.5 ·OH scavenging capability of different polysaccharide

圖6 不同濃度多糖對(duì)·的清除活性Fig.6 scavenging capability of different polysaccharid

圖7 不同濃度多糖的還原能力Fig.7 Reducing power of different polysaccharide

3 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定超聲輔助提取滑子菇多糖的最佳提取條件是:超聲頻率為80Hz、超聲時(shí)間為15min以及液料比為20∶1，在此工藝條件下多糖的得率為11.219%。3個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響程度不同，其中超聲頻率影響最明顯，其次是超聲時(shí)間，而液料比對(duì)提取得率影響不大。粗多糖對(duì)DPPH·、·和·OH都有一定的清除活性，有量效關(guān)系，清除·OH活性最高，清除·活性最低，通過(guò)自由基清除活性實(shí)驗(yàn)證明該多糖具有一定的抗氧化活性。

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