大孔樹脂純化番石榴多酚的工藝優(yōu)化

曹增梅，黃 和(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088)

番石榴(Psidium guajava L)，又名雞矢果、拔子，屬于桃金娘科(Myrtaceae)，番石榴屬(Psidium)，常綠多年生的灌木植物，現(xiàn)在臺(tái)灣、廣東、廣西、福建等省均有栽培［1］。植物多酚是一種具有多羥基化合物的總稱，具有抗氧化、抗病毒、抑菌消炎等功效［2］。已有研究表明番石榴中含有沒食子酸、兒茶素、槲皮素、香草酸等多種多酚類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化功能［3］，但目前對番石榴多酚的研究較少，尚無番石榴多酚純化方面的研究報(bào)道，可見對番石榴中多酚類物質(zhì)的研究很有必要。大孔樹脂是一類不溶于酸、堿和各種有機(jī)溶劑，具有較好吸附性的有機(jī)高分子聚合物，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附量大、選擇性好、吸附速度快等優(yōu)點(diǎn)［4］，近年來大孔樹脂在黃酮、多酚等活性物質(zhì)的分離純化的應(yīng)用越來越廣泛［5-6］。本文通過考察大孔樹脂對番石榴多酚的純化效果，通過吸附、解吸實(shí)驗(yàn)，選擇適宜的樹脂，并對其分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番石榴 購于湛江愛佳超市，產(chǎn)地湛江;大孔樹脂AB-8、S-8、D101、NKA-9 上海摩速科學(xué)器材有限公司;大孔樹脂HP-20 日本三菱化學(xué)公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;722S可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;BL-620S電子天平 日本SHIMADZU公司;SIGMA3-18K高速冷凍離心機(jī) 北京博勵(lì)行儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 多酚含量的測定 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-ciocalteu(FC)法測定番石榴中多酚總含量［7］，稱取沒食子酸 0.05g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL，得濃度為0.05mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確吸取0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8mL 置于 50mL 的棕色容量瓶中，分別加入FC試劑4.0mL，混勻，在0.5～5min內(nèi)加入4mL 10%Na2CO3溶液，充分混合后定容，室溫下避光放置lh，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的溶液為空白對照，在760nm波長下測定吸光度值，每個(gè)樣品平行測定3次。

1.2.3 大孔樹脂的預(yù)處理 樹脂分別用95%乙醇浸泡24h，充分溶脹，用傾倒法去除上浮的樹脂碎片和雜物，更換乙醇浸泡，直至上清液加適量水后無混濁，再用1mol/L HCl溶液浸泡8h，蒸餾水沖洗至中性，然后用1mol/L NaOH溶液浸泡8h，最后用蒸餾水沖洗至中性，備用。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸

1.2.4.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取1.0g濕樹脂于50mL錐形瓶中，加入樣品溶液10mL，置于搖床上振蕩12h，過濾，測定濾液中多酚的含量，根據(jù)以下公式計(jì)算吸附量、吸附率，考察樣品溶液的pH對樹脂吸附性能的影響。

式中:Q為吸附量，mg/g;A為吸附率，%;C0為起始濃度，mg/mL;C1為平衡濃度，mg/mL;V為吸附溶液體積，mL;W為樹脂重量，g。

1.2.4.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 將充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗至樹脂表面無提取溶液殘留，用濾紙吸干水分，加入乙醇溶液30mL，置于搖床上振蕩12h，充分解吸后過濾，測定濾液中多酚含量，按式(3)計(jì)算解吸率，考察洗脫液的濃度和pH對樹脂洗脫性能的影響。

式中:B為解吸率，%;C2為解吸液中多酚濃度，mg/mL;V為吸附溶液體積，mL;W為樹脂重量，g;Q為吸附量，mg/g。

1.2.5 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸 將預(yù)處理好的大孔樹脂濕法裝入玻璃層析柱(1.6cm×40cm)中，蒸餾水平衡后，將樣品溶液以一定的流速上柱并收集流出液，每4mL為一管，根據(jù)流出液的濃度，計(jì)算多酚動(dòng)態(tài)吸附率，考察樣品溶液流速、樣品溶液濃度等因素對樹脂吸附性能的影響，確定最佳吸附工藝條件。

三是無法剝離型財(cái)產(chǎn)。關(guān)聯(lián)性企業(yè)中往往存在著交叉型財(cái)產(chǎn)，所謂交叉型財(cái)產(chǎn)是在企業(yè)合法運(yùn)營程序和非法運(yùn)營本質(zhì)的共同作用下產(chǎn)生的財(cái)產(chǎn)。這部分財(cái)產(chǎn)不具有典型的涉黑財(cái)產(chǎn)本質(zhì)，但在財(cái)產(chǎn)獲取或者流向上存在部分非法的狀態(tài)。由于財(cái)產(chǎn)具有不可分性或者財(cái)產(chǎn)非法成分具有不可估價(jià)性，或許會(huì)導(dǎo)致合法財(cái)產(chǎn)無法從中予以剝離的情形。為了從根本上打擊關(guān)聯(lián)性企業(yè)，應(yīng)當(dāng)將此部分財(cái)產(chǎn)作為單純性涉黑財(cái)產(chǎn)來進(jìn)行整體性處置，但是存在善意相對人的情況應(yīng)當(dāng)保留其對財(cái)產(chǎn)的相關(guān)訴訟權(quán)利，以做到公平公正、不傷及無辜。

對已吸附飽和的樹脂進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，用蒸餾水洗至無還原糖，以一定的流速用適當(dāng)濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，通過計(jì)算解吸率，考察洗脫液體積、洗脫流速等對樹脂洗脫性能的影響，確定最佳洗脫條件。按優(yōu)化后的條件上柱，吸附、洗脫，收集洗脫液，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線，合并含量高的洗脫液，制成番石榴多酚粉末，計(jì)算回收率和純度。

式中:R為回收率，%;C0為粗提液多酚的起始濃度，mg/mL;V0為上樣液的體積，mL;C2為洗脫液中多酚濃度，mg/mL;V2為洗脫液體積，mL;M為多酚樣品的重量(干重)，mg;P為樣品中多酚的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒食子酸在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/mL)，吸光度值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。得到的回歸方程為:y=0.11x+0.014，R2=0.9994，說明該曲線具有較好的線性關(guān)系。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.2 樹脂篩選結(jié)果

大孔樹脂的物理結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)不同，對多酚的吸附和解吸效果也不同，表1顯示了5種大孔樹脂對番石榴粗提液中多酚的靜態(tài)吸附量、吸附率和解吸率。

表1 5種大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸性能的比較分析Table 1 Static adsorption and desorption analysis of five macroporous resins

由表1可知，樹脂NKA-9的吸附量明顯高于其他樹脂，可能是因?yàn)镹KA-9的極性與番石榴多酚的極性相近，而且，NKA-9的解吸效果較好，故確定NKA-9為分離純化番石榴多酚的最佳樹脂。

2.3 靜態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化

2.3.1 粗提液pH對樹脂吸附效果的影響 吸附過程中吸附質(zhì)以分子形態(tài)容易被吸附劑吸附，因此吸附要達(dá)到較好的效果，必須使吸附質(zhì)保持分子狀態(tài)［8］。如圖2所示，當(dāng) pH為2時(shí)，樹脂對多酚的吸附效果最好，隨著酸性減弱，多酚的吸附量逐漸減少，這是因?yàn)槎喾泳哂蟹恿u基，易于電離，酸性條件保證多酚以分子形態(tài)存在，故吸附效果好。

2.3.2 乙醇濃度對樹脂解吸效果的影響 如圖3所示，隨著乙醇濃度的提高，解吸率逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%后，進(jìn)一步增大乙醇濃度，解吸率增加不明顯，這可能是由于解吸劑的極性在一定程度上影響吸附質(zhì)的解吸［9］。實(shí)驗(yàn)中為了減少試劑浪費(fèi)，節(jié)約成本，選用50%的乙醇對番石榴多酚進(jìn)行洗脫。

2.3.3 解吸液pH對解吸效果的影響 如圖4所示，隨著解吸劑pH的增大，解吸能力逐漸增強(qiáng)，pH為3.0時(shí)達(dá)到最大，pH繼續(xù)升高，解吸率反而下降。這可能是因?yàn)閜H為3.0時(shí)，樹脂與多酚之間的相互作用較弱，多酚易被洗脫。

圖2 pH對多酚吸附量的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption capacity of polyphenols

圖3 乙醇濃度對多酚解吸率的影響Fig.3 Effect of ethnol concentration on adsorption rate of polyphenols

圖4 pH對多酚解吸率的影響Fig.4 Effect of pH on desorption rate of polyphenols

2.4 動(dòng)態(tài)吸附與解吸條件的優(yōu)化

2.4.1 上柱流速對樹脂吸附效果的影響 一般來說上樣速度慢，有利于樹脂對多酚的吸附，流速過快，樣液中部分多酚物質(zhì)會(huì)來不及擴(kuò)散到樹脂的內(nèi)表面，就被沖出柱子，導(dǎo)致樹脂對多酚物質(zhì)吸附量降低，但流速過低，操作時(shí)間長，影響生產(chǎn)效率［10］。如圖5，隨著流速的增加，多酚的吸附量逐漸降低，在0.5、1.0mL/min速率下，樹脂的吸附率相差不大，因此選擇速率為1.0mL/min。

2.4.2 上樣濃度對樹脂吸附效果的影響 一般來說，大孔樹脂的吸附量一般與上樣濃度成反比，低濃度有利于吸附［11］。如圖6所示，上樣濃度較低時(shí)，吸附率變化不明顯，隨著上樣濃度的增加，樹脂的吸附率逐漸降低，所以吸附液濃度以1.2mg/mL為宜。

2.4.3 解吸劑流速對樹脂解吸效果的影響 解吸流速一般要求慢，因?yàn)榱魉龠^快，解吸帶寬，且拖尾嚴(yán)重，解吸不完全，但流速過慢，又會(huì)延長生產(chǎn)周期［8］，生產(chǎn)中應(yīng)綜合考慮。如圖7所示，隨著解吸速率的增加，解吸率逐漸下降，解吸速率為1mL/min時(shí)解吸效果較好，因此選擇解吸劑流速為1mL/min。

圖5 流速對多酚吸附率的影響Fig.5 Effect of flowing rate on adsorption rate of polyphenols

圖6 多酚濃度對吸附率的影響Fig.6 Effect of polyphenols concentration on adsorption rate

圖7 流速對多酚解吸率的影響Fig.7 Effect of flowing rate on desorption rate of polyphenols

2.4.4 動(dòng)態(tài)洗脫曲線 如圖8可以看出，NKA-9樹脂上吸附的多酚物質(zhì)極易洗脫，多酚的洗脫峰相對集中，對稱，無拖尾現(xiàn)象。當(dāng)洗脫量達(dá)到30管時(shí)，洗脫液中多酚含量已經(jīng)很低，可認(rèn)為已基本洗脫完全，因此，洗脫量為3BV 50%的乙醇。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取一定量的番石榴多酚粗提物，用蒸餾水溶解，按上述確定的優(yōu)化工藝條件上柱、吸附，洗脫，收集流出液和洗脫液，經(jīng)濃縮、干燥得精制番石榴多酚產(chǎn)品，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，多酚的平均吸附率和解吸率分別為90.5%和89.3%，產(chǎn)品純度為46.5%。

3 結(jié)論

3.1 通過靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)得出，NKA-9具有良好的吸附性能，是初步分離純化番石榴多酚的優(yōu)良材料。

圖8 NKA-9大孔樹脂動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.8 Dynamic elution curve of NKA-9 resin

3.2 當(dāng)樣液多酚濃度為1.2mg/mL，pH為2時(shí)，以1.0mL/min的流速上樣，NKA-9型樹脂對番石榴多酚的吸附率最高，達(dá)到90.5%。

3.3 以50%的乙醇作為洗脫劑，pH為3，洗脫速度為1mL/min時(shí)，洗脫效果較好，洗脫率可達(dá)89.3%，洗脫液經(jīng)過冷凍干燥，多酚純度達(dá)到46.5%。

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