金黃色葡萄球菌拮抗菌株的篩選及鑒定

李成海，贠建民，艾對元，張紊瑋，顏東方

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

隨著食品工業(yè)的快速增長，人們對食品防腐劑的安全性以及食品的保質(zhì)期問題提出了更高的要求。一些食品腐敗菌如金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)等嚴重危害著食品安全，如何防止食品腐敗變質(zhì)及開發(fā)安全的食品防腐劑越來越受到重視。研究表明，一些化學合成防腐劑存在一定的安全隱患，如苯甲酸鹽可能會引起食物中毒現(xiàn)象，硝酸鹽和亞硝酸鹽可能會生成致癌的亞硝胺［1］。而微生物防腐劑如Nisin、Natamycin等因其安全性高、性能好，而且不影響食品風味，在食品防腐方面具有很高的應(yīng)用價值［2］。因此，開發(fā)安全、高效、健康的新型微生物防腐劑成為當今食品工業(yè)發(fā)展的趨勢。從極端生境中分離具有活性功能的微生物已越來越受到重視。目前有研究已經(jīng)從干旱生境中篩選出具有活性功能的微生物［3］，如能產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的沙漠放線菌產(chǎn)抗癌菌素濕性鏈霉菌(Streptomyces humidus subsp.Antitumoris)、達松威爾擬諾卡菌(Nocardiopsis dassonvillei)和易變鏈霉菌(Streptomyces mutabilis)，以及產(chǎn)胞外多糖高達7445.80mg/L的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)［4］。為此，本實驗擬以甘肅中部干旱生境土壤為分離材料，開展拮抗金黃色葡萄球菌的菌株篩選，旨在為構(gòu)建和豐富防腐微生物種質(zhì)資源庫提供菌種來源，為相關(guān)企業(yè)開發(fā)微生物防腐劑新產(chǎn)品提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 土樣來源 從甘肅中部定西市干旱北山山坡，用滅過菌的鏟子除去表面1～2cm的土層，以表層下3～4cm深度為基準采集土樣，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌株 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、表皮葡萄球菌 (Stapyloccocush epidermidis)均由甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院微生物實驗室保藏;結(jié)核分歧桿菌(Mycobacterium tuberculosis)由蘭州大學醫(yī)學院微生物實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 高氏1號培養(yǎng)基，用于樣品中細菌的分離;牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，用于拮抗細菌的活性菌株篩選;牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，作為指示菌的活化及發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.4 主要實驗儀器 SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化;YX-280A高壓滅菌鍋 上海三申;HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠;THZ-82N臺式恒溫振蕩器 上海躍進;PB203-N電子天平 上海精密科學儀器廠;XP-200顯微鏡上海繪統(tǒng)光學儀器有限公司;PCR反應(yīng)擴增儀 加拿大BBI公司;3730測序列分析儀 美國ABI公司;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司;DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海琪特分析儀器有限公司;YXJ-2離心機 湘儀離心機儀器有限公司;H6-1微型電泳槽 上海精益有機玻璃制品儀器廠;凝膠成像系統(tǒng) Gene Genius公司;移液器 加拿大BBI公司。

1.2 菌株的分離、純化［5］

稱取研細土樣5g，加入盛有45mL無菌水的三角瓶中，搖床振蕩20min。吸取1mL土壤懸浮液到9mL無菌水中稀釋得10倍液，依次按10倍法稀釋到10-6一系列稀釋液。分別取10-4、10-5和10-6稀釋液0.2mL，用涂布平板法均勻接種到高氏1號培養(yǎng)基上，每個處理三個重復。將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～7d。挑取單菌落，分離純化后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 拮抗菌株的篩選

1.3.1 指示菌的活化 將各供試指示菌斜面菌苔分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)36h;連續(xù)培養(yǎng)3～4代種子液，用無菌水稀釋至濃度為107CFU/mL［6］的菌懸液，制備長有指示菌的營養(yǎng)固體平板。

1.3.2 拮抗菌株的初篩 采用點接法篩選。將分離出的菌株分別點接在涂有指示菌的營養(yǎng)固體平板上，每個平板三個重復，以未涂指示菌的平板為對照，培養(yǎng)72h，觀察抑菌情況。

1.3.3 拮抗菌株的復篩 發(fā)酵液的制備［7］:將拮抗菌在無菌條件下接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)5d;發(fā)酵液在4500r/min離心15min后，取上清液，備用。

參照馬永全等［8］的方法，取已滅菌的牛津杯置于涂有指示菌的平板上，吸取拮抗菌發(fā)酵液0.3mL滴加于牛津杯中，每個平板放3個牛津杯，設(shè)空白對照，培養(yǎng)24h，觀察抑菌情況。并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，計算抑菌效價。

式中:X為抑菌圈直徑(mm);Y為牛津杯直徑:8mm;V為發(fā)酵液體積(μL)。

1.3.4 抑菌最低濃度稀釋梯度的測定 吸取1mL待測菌發(fā)酵液到9mL無菌水中稀釋得10倍液，依次按10倍法稀釋到10-7一系列稀釋液。分別對各梯度發(fā)酵液通過牛津杯法對指示菌進行抑菌實驗，每個平板放3個牛津杯，并設(shè)置空白對照，培養(yǎng)24h，觀察抑菌情況。

1.4 拮抗菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學特征 用接種針挑取拮抗菌菌苔少許進行涂片，然后用酒精燈加熱固定，對固定好的菌株采用美藍染液染色1min，水洗后干燥，鏡檢。

革蘭氏染色［9］:用接種針挑取拮抗菌菌苔少許涂片固定;用草酸銨結(jié)晶紫染1min，水洗;加碘液媒染1min，水洗;經(jīng)95%乙醇脫色20s后水洗;蕃紅復染2min后，水洗;干燥，鏡檢。

1.4.2 生理生化特征 將拮抗菌株在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上36℃活化培養(yǎng)48h，參照東秀珠等［10］的方法，對其培養(yǎng)物分別進行接觸酶、V-P測定、產(chǎn)色素、還原硝酸鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽厭氧生長、H2無機化能營養(yǎng)、水解明膠、水解淀粉、乙酰胺水解、糖產(chǎn)酸、醋酸鹽、己二酸鹽、庚二酸鹽、辛二酸鹽、酒石酸鹽、衣康酸鹽、異-戊酸鹽、正-戊酸鹽及糖醇類發(fā)酵實驗。

1.4.3 16S rDNA分子生物學鑒定 菌株基因組的提取:菌株基因組按照生工SK1201-UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取。

1.4.4 16S rDNA基因擴增序列測序及分析 將提取的基因組DNA委托生工生物工程(上海)有限公司進行16S rDNA基因擴增序列測序。測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，進行Blast比對，選擇近緣10株菌的 16S rDNA 序列，用 MEGA 4.0［11］進行多重比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap測試，設(shè)置重復次數(shù)為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離、純化結(jié)果

把土壤懸液經(jīng)系列稀釋后采用涂布法接種于高氏1號平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后挑取單菌落，共分離得到32株菌，編號，將這些菌株在高氏1號斜面上培養(yǎng)，4℃保存，備用。

2.2 抗菌活性菌株的篩選結(jié)果

2.2.1 初篩結(jié)果 對分離到的32株菌開展拮抗實驗，初篩到一株對金黃色葡萄球菌具有拮抗作用的菌株A-2，見圖1。

圖1 拮抗菌A-2對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of antagonistic strain A-2 on S.aureus

2.2.2 復篩結(jié)果及抑菌譜測定 以菌株A-2的發(fā)酵液通過牛津杯法復篩，證明其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、植物乳酸桿菌和表皮葡萄球菌具有顯著的抑菌效果，而對枯草芽孢桿菌和結(jié)核分歧桿菌沒有抑菌效果。由于本實驗發(fā)酵液中菌體未經(jīng)破壁處理，表明該抗菌活性物質(zhì)為胞外產(chǎn)物。

2.2.3 抑菌最低濃度稀釋梯度的測定結(jié)果 A-2發(fā)酵液經(jīng)稀釋后，對金黃色葡萄球菌進行抑菌實驗，抑菌效果見表2。

由表2可知，發(fā)酵液稀釋到10-6濃度梯度仍對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、植物乳酸桿菌和表皮葡萄球菌具有抑菌效果，發(fā)酵液在10-7濃度梯度對各指示菌沒有抑菌效果，表明拮抗菌的抑菌最低濃度稀釋梯度為10-6，因此，該拮抗菌株有深入研究的價值，有必要對其種屬進行鑒定。

表1 拮抗菌A-2的抑菌效價Table 1 The antibacterial titer of antagonistic strain A-2

表2 各稀釋梯度發(fā)酵液的抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of the dilute fermented broth

2.3 拮抗菌株A－2的鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株A-2的形態(tài)特征 菌株A-2的形態(tài)如圖2。

圖2 拮抗菌A-2的形態(tài)照片(10×100)Fig.2 Form photo of antagonistic strain A-2(10×100)

由圖2可知，拮抗菌株A-2的細胞形態(tài)為球狀或短桿狀，0.5～2μm ×0.5～2.6μm，菌體單一或鏈狀排列，無芽孢。經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢為紅色，為革蘭氏陰性細菌。

2.3.2 A-2菌株的生理生化特征 實驗結(jié)果見表3。

綜合拮抗菌A-2的各項生理生化特征，對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)的屬、種的相關(guān)性狀，將拮抗菌A-2鑒定為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)。

2.3.3 16S rDNA分子生物學鑒定結(jié)果 A-2菌株的PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖3。由圖3電泳圖譜可知，從該菌株提取16S rDNA的PCR產(chǎn)物，其純度很高，只有一個條帶，根據(jù)Mark比對，其堿基對為1300bp左右。將拮抗菌 A-2的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，進行Blast比對，選擇近緣10株菌的16S rDNA序列，應(yīng)用MEGA 4.0軟件進行多重比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行Bootstrap測試，設(shè)置重復次數(shù)為1000次。A-2的系統(tǒng)進化樹如圖4。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 The electrophoresis pattern of PCR products

圖4 A-2系統(tǒng)進化樹Fig.4 System evolutionary tree of the strain A-2

表3 拮抗菌A-2的生理生化特征Table 3 The physiological and biochemical characters of antagonistic strain A-2

由圖4可知，金黃色葡萄球菌拮抗菌A-2與Alcaligenes sp.(HQ262549)位于同一分支，1000次bootstrap分析支持該分支;并且A-2菌株在GenBank數(shù)據(jù)庫比對中與Alcaligenes sp.(HQ262549)的相似度高達99.1%。

綜合其形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，將該拮抗菌株A-2鑒定為Alcaligenes sp.(HQ262549)。

3 結(jié)論與討論

微生物產(chǎn)生的活性物質(zhì)大多為次級代謝產(chǎn)物，次級代謝產(chǎn)物形成的途徑及種類與其生存環(huán)境息息相關(guān)，由于適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，它們形成極為特殊的生理機制，并產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物［12］。有關(guān)Alcaligenes屬菌株產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的研究已有報道，例如，沈穎從細薄星芒海綿中分離得到的一株糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)A72，其次級代謝物(環(huán)D-脯氨酸D-苯丙氨酸)對多株指標菌有抗菌活性［13］;林建朋從深海中篩選的海洋糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)WL24，其次級代謝產(chǎn)物(一種抗菌蛋白)對水稻紋枯病、柿子炭疽病、玉米小斑病及蔬菜灰霉病等多種植物病原真菌有較強拮抗效果［14］;Haruyama等人從(Alcaligenes faecalis SANK 74291的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的B-1015是一種廣譜抗生素，可以抑制革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌［15］;Tokunaga等人從糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)YL-026325發(fā)酵產(chǎn)物中分離的Kalimantacins A、B、C對表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)有很好的抑制作用［16］?？傊?，現(xiàn)已研究報道的這些菌株均為來自海泥或海洋動物共生菌。而本研究是以甘肅中部典型干旱生境(年降雨量僅為413.94mm)土壤為分離材料，首次分離獲到了一株Alcaligenes屬細菌，經(jīng)形態(tài)學、生理生化及16S rDNA分子生物學方法鑒定，該拮抗菌為產(chǎn)堿桿菌屬菌株Alcaligenes sp.。其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、植物酸桿菌和表皮葡萄球菌均具有顯著抑菌活性，其發(fā)酵液對4株供試食品腐敗菌的抑菌最低濃度稀釋梯度均為10-6，具有開發(fā)新型微生物防腐劑的潛力。

由于其干旱、營養(yǎng)貧瘠的生活環(huán)境與海洋生境迥異，因而長期的生長適應(yīng)性必然導致微生物具有獨特的生存對策及生理代謝途徑，很可能不同于海洋微生物的代謝機制，并產(chǎn)生獨特種類及結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物。鑒于此，對于Alcaligenes sp.A-2菌株產(chǎn)生的次級代謝活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)及其特性有待進一步深入研究。

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