洪澤湖野生河蜆抗氧化肽酶解工藝及清除自由基能力的研究

劉晶晶，顧 云，黃 婷，韓曜平，王雪鋒，戴陽軍，蘇 慧

(1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500;2.高淳縣質(zhì)量計量檢測所，江蘇南京211300)

目前國內(nèi)使用的抗氧化劑大多由化學(xué)合成，而一直以來，人們對化學(xué)合成抗氧化劑的安全性早有質(zhì)疑。世界衛(wèi)生組織、歐共體兒童保護(hù)組織、英國生物工業(yè)協(xié)會、日本和美國政府及組織的研究表明，合成抗氧化劑有很多副作用，例如對人體的肝、脾、肺有不利影響，可誘發(fā)惡性腫瘤等。在人們長期食用的食品中，天然抗氧化劑成分的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人工化學(xué)合成的抗氧化劑毒性。因此，作為最活躍的研究課題之一，從自然界中尋求天然抗氧化劑的研究已引起科研學(xué)者的高度重視，研究和開發(fā)天然抗氧劑的興趣也呈指數(shù)式增長。特別是利用生物酶技術(shù)水解魚類、貝類，酶解液表現(xiàn)強(qiáng)抗氧化活性［1-2］。河蜆是雙殼類軟體動物，經(jīng)濟(jì)價值高，肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，而且具有較好的藥用效果。河蜆含七種人體必需氨基酸，其中兩種為人體半必需氨基酸，蛋白質(zhì)含量高于牡蠣［3］、文蛤［4］、翡翠貽貝［5］、美洲簾蛤［6］。河蜆軟體部分中必需氨基酸組成相對均衡，接近FAO/WHO(1973)提出的人體必需氨基酸均衡模式。河蜆體內(nèi)富含 K、Na、Ca、Mg、Fe等常量元素和 Zn、Cu、Mn等微量元素，顯示它具有很高的營養(yǎng)保健價值，即值得進(jìn)一步開發(fā)生產(chǎn)［7］。作為中藥藥材，河蜆具有開胃、通乳、明目、利尿、去濕毒、治療肝病、麻疹、退熱、止咳化痰、解酒等功效［8］。洪澤湖野生河蜆更因其品質(zhì)優(yōu)良、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、個體大等特點(diǎn)在國內(nèi)外市場享有很高的聲譽(yù)。本實驗以洪澤湖野生河蜆為原料，探討抗氧化肽的酶解工藝條件及其清除自由基能力，為河蜆的深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洪澤湖野生河蜆 江蘇省宿遷楠景水產(chǎn)品有限公司;木瓜蛋白酶 酶活力大于6000U/mg，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶 酶活力1000～1500U/mg，購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;維生素C、BHT、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、DPPH標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、鄰二氮菲、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵等試劑 均為分析純。

Anke LXJ-ⅡB離心沉淀機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;722s可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;722紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;FA 2004電子精密天平 上海儀器天平廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 河蜆肉的預(yù)處理 將河蜆肉流水解凍，在低溫條件下，按1∶3的料液比加水后用組織搗碎機(jī)勻漿，即為河蜆漿液。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 不同復(fù)配比例蛋白酶酶解液的清除羥自由基能力 取一定量的河蜆漿液，調(diào)節(jié)pH為6，分別加入蜆肉質(zhì)量0.5%的不同復(fù)合比的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶(0∶5、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1、5∶0)，50℃下酶解 3h，100℃滅酶20min、離心后得到不同比例蛋白酶的酶解液，分別測定其·OH清除率。

1.2.2.2 初始pH的確定 取一定量的河蜆漿液，調(diào)節(jié)其 pH 分別為 3、4、5、6、7，加入 0.5% 胰蛋白酶，50℃下酶解4h，100℃滅酶20min、離心后得到不同初始pH的酶解液，分別測定其·OH清除率。

1.2.2.3 酶解時間的確定 取一定量的河蜆漿液，調(diào)節(jié)其pH為4，加入0.5%胰蛋白酶，在50℃下分別酶解 1、2、3、4、5h，100℃滅酶 20min、離心后得到不同酶解時間的酶解液，分別測定其·OH清除率。

1.2.2.4 酶解溫度的確定 取一定量的河蜆漿液，調(diào)節(jié)其pH為4，加入0.5%胰蛋白酶，分別在30、40、50、60、70℃下酶解 4h，100℃滅酶 20min、離心后得到不同酶解時間的酶解液，分別測定其·OH清除率。

1.2.3 清除自由基能力的測定 清除羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由(·)和二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)能力的測定，按參考文獻(xiàn)［9-11］方法測定。

1.2.4 還原能力的測定 采用普魯士藍(lán)反應(yīng)法［12］比較河蜆酶解液、VC、BHT的還原能力。向0.4mL樣品中加入0.2mol/L、pH6.6的磷酸緩沖溶液2mL，10g/L的鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］溶液2mL，混勻，在50℃下保溫20min;加入10%三氯乙酸溶液2mL，振蕩混勻后在4000r/min下離心10min;取上清液2mL，加2mL蒸餾水和0.4mL 1g/L的FeCl3溶液，靜置10min后體系溶液由黃色變?yōu)樗{(lán)色，在700nm下進(jìn)行比色;分別記錄其吸光值，平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗至少3次重復(fù)，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)配比例蛋白酶酶解液的清除羥自由基能力

由圖1可知，在相同反應(yīng)條件下，單一胰蛋白酶酶解液的清除羥自由基效果優(yōu)于復(fù)合蛋白酶，復(fù)合蛋白酶中胰蛋白酶的比例越大，清除效果越強(qiáng)，單一木瓜蛋白酶酶解液的清除羥自由基能力最弱。推測原因可能是，各種蛋白酶水解反應(yīng)條件和產(chǎn)物多肽的N-末端、C-末端氨基酸組成和序列不同，木瓜蛋白酶與胰蛋白酶也不能產(chǎn)生協(xié)同作用，影響了活性物質(zhì)清除羥自由基的能力?；谠擁棓?shù)據(jù)，本實驗采用胰蛋白酶來探討河蜆抗氧化活性肽的酶解工藝條件。

圖1 不同復(fù)合比(木瓜蛋白酶:胰蛋白酶)酶解液的羥自由基清除率Fig.1 Effect of hydrolysates produced by different compound ratio(Papain:Trypsin)on scavenging rate of hydroxyl radical

2.2 最佳酶解條件(以·OH清除率計)的確定

2.2.1 初始pH的確定 從圖2可以看出，反應(yīng)體系的pH對酶解液清除·OH的能力有較大影響，酶解液的·OH清除率隨初始pH的增加而先增后降，在pH4時達(dá)到最大值。蛋白酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其催化反應(yīng)的能力受反應(yīng)環(huán)境pH影響，具體表現(xiàn)為pH會影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，另外pH也會影響酶分子及底物、酶-底物復(fù)合物的解離。偏離最適pH時酶的活性逐漸降低，因此體系過酸或過堿均不利于酶促反應(yīng)，數(shù)據(jù)表明，該反應(yīng)的最適pH為4，此時酶解液清除·OH能力最高。

圖2 初始pH對·OH清除率的影響Fig.2 Effect of initial pH on the scavenging rate of hydroxyl radicals

2.2.2 酶解時間的確定 由圖3可以看出，酶解液的·OH清除率隨著酶解時間的增加而先增后降，在酶解4h時達(dá)到最大值。這是由于酶解初期，酶量充足，底物可斷裂的肽鍵較多，酶解液中抗氧化肽含量上升較快。酶解一定時間后，酶解液中抗氧化肽的含量增加緩慢，且隨著水解時間的延長，抗氧化肽含量增加不明顯且隨著時間的延長抗氧化肽活性下降。

圖3 酶解時間對·OH清除率的影響Fig.3 Effect of time on the scavenging rate of hydroxyl radicals

2.2.3 酶解溫度的確定 由圖4可知，在初始pH、酶解時間相同，酶解溫度不同的反應(yīng)條件下，酶解液清除·OH能力的變化情況，其中50℃時酶解液的·OH清除率最高。因為蛋白酶有其自身最適宜反應(yīng)溫度，在最適溫度時，酶活力最強(qiáng)，酶解效果最好，酶解液清除·OH的能力最強(qiáng)。低于或高于最適溫度時，酶活力下降，酶解液清除·OH的能力也隨之下降。

圖4 酶解溫度對·OH清除率的影響Fig.4 Effect of temperature on the scavenging rate of hydroxyl radicals

2.2.4 L9(34)正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，添加0.5%的胰蛋白酶，選用初始pH、酶解溫度、酶解時間為實驗因素，以·OH清除率為評判指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實驗。正交實驗因素水平及結(jié)果見表1。

從表1的極差分析結(jié)果可知，影響·OH清除率的各因素的主次關(guān)系為:A(初始pH)＞C(酶解時間)＞B(酶解溫度)，酶解的最佳工藝(以·OH清除率計)為:初始pH為3.5，酶解時間為3.5h，酶解溫度為45℃。

2.2.5 驗證實驗 在酶解最優(yōu)條件下，即初始pH為3.5，酶解時間為3.5h，酶解溫度為45℃的條件下，所得酶解液·OH清除率為76.19%。

2.3 與VC、BHT在不同體外抗氧化模型下的比較結(jié)果

2.3.1 清除羥離子自由基能力比較 從圖5看出，河蜆酶解液、VC和BHT均有較好的清除羥自由基能力，三者的清除率分別為74.82%、89.48%、91.65%，其中相同濃度的VC和BHT清除羥自由基能力之間沒有顯著性差異。而相同濃度的河蜆酶解液的羥自由基清除能力和VC與BHT之間差異較顯著。

表1 ·OH清除率的正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design and results of the scavenging rate of hydroxyl radicals

圖5 酶解液、VC及BHT對羥自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of enzymatic hydrolysate，VCand BHT on hydroxyl radical

2.3.2 清除超氧陰離子自由基能力比較 如圖6所示，河蜆酶解液對超氧陰離子的清除率為24.61%，而VC對超氧陰離子有較好的清除作用，達(dá)到56.7%;其中河蜆酶解液對超氧陰離子的清除作用與VC之間呈顯著性差異，和BHT之間呈非顯著性差異。

2.3.3 還原能力比較 如圖7所示，河蜆酶解液的還原能力與VC相近，A700nm分別為0.381和0.404，且與VC之間呈非顯著性差異;而BHT的還原能力相對較弱，其 A700nm為0.316，與河蜆酶解液之間呈顯著性差異。

2.3.4 清除二苯代苦味肼基自由基能力比較 如圖8所示，VC有很強(qiáng)的清除二苯代苦味肼基自由基能力，BHT次之，河蜆酶解液清除DPPH·的能力最弱，其清除率僅為24.04%;且三者之間均呈顯著性差異。

圖6 酶解液、VC及BHT對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of enzymatic hydrolysate，VCand BHT on superoxide radical

圖7 酶解液、VC及BHT的還原能力Fig.7 Reducing power of enzymatic hydrolysate，VCand BHT

圖8 酶解液、VC及BHT對DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of enzymatic hydrolysate，VCand BHT on DPPH radical

3 結(jié)論

3.1 在相同反應(yīng)條件下，單一胰蛋白酶酶解液的清除羥自由基效果優(yōu)于復(fù)合蛋白酶;復(fù)合蛋白酶中胰蛋白酶的比例越大，清除效果越強(qiáng);單一木瓜蛋白酶酶解液的清除羥自由基能力最弱。

3.2 經(jīng)過L9(34)正交實驗分析，酶解的最佳工藝(以·OH清除率計)為:初始pH為3.5，酶解時間為3.5h，酶解溫度為45℃，所得酶解液·OH清除率為76.19%。

3.3 清除自由基能力的實驗結(jié)果表明，河蜆酶解液對超氧陰離子的清除率高于BHT，對羥自由基、二苯代苦味肼基自由基的清除率均低于BHT，此外，河蜆酶解液的還原能力與同濃度的VC接近，高于同濃度BHT的還原能力。綜合考慮到BHT作為化學(xué)合成抗氧化劑有使用限量(200μg/mL)，且實驗并未將酶解液抗氧化肽分離純化，所以河蜆酶解液的清除自由基能力與BHT相近。

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